lnc RNA10913在脂多糖誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用研究＊

戴巍，駱德強(qiáng)，胡世林，錢克儉

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南昌330006；2.江西省上饒市第五人民醫(yī)院，上饒334000)

膿毒癥作為世界公共衛(wèi)生的主要威脅，其發(fā)病率和死亡率都很高，而由感染引起的膿毒癥則更為突出[1]。先天免疫系統(tǒng)作為抵御病原體入侵的第一道防線，免疫反應(yīng)中的巨噬細(xì)胞起著關(guān)鍵的增強(qiáng)作用[2,3]。在病原體入侵時，Toll樣受體4檢測到脂多糖（LPS），并引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞被激活，導(dǎo)致腫瘤壞死因子α(TNFα)，白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子大量釋放。過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織器官的損傷，因此尋求有效的干預(yù)途徑有著重要的意義。非編碼RNA（ncRNAs）按大小主要分為長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）和小RNA（small RNAs,sRNAs）兩大類。lncRNA為200多個核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本，生物功能多種多樣。在轉(zhuǎn)錄的招募、表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后修飾及表觀遺傳等過程中，lncRNA調(diào)控著特異性基因的表達(dá)[4]，通過與DNA、蛋白及RNA的相互作用，參與先天和適應(yīng)性免疫功能等方面的調(diào)節(jié)。在生理和病理?xiàng)l件下，在維持組織的穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。研究表明lncRNA也可能是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[6,7]。因此研究lncRNA與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)系對于膿毒癥的診治有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞系購自上海中科院細(xì)胞庫；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國GIBCO公司；LPS購自美國Sigma公司，RT試劑購自Western Biotechnology公司；RNA提取試劑盒購自日本Takara公司；TNF-α、IL-6的ELISA檢測試劑盒均購自北京麗科公司；PCR引物由威斯騰生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA測序和數(shù)據(jù)分析 將NR8383細(xì)胞以106個的密度接種于每孔含2ml培養(yǎng)基的6孔板中，待細(xì)胞生長至50%時采用1μg/ml的LPS刺激細(xì)胞，分別于2h、9h后收集LPS處理過的細(xì)胞及未處理的NR8383細(xì)胞，每組均含3個樣本，提取總RNA后交由華大基因公司構(gòu)建測序文庫，通過Illumina HiSeqTM2000平臺進(jìn)行l(wèi)ncRNA高通量測序。

1.2.2 LPS誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞損傷模型建立及分組 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞系按說明書培養(yǎng)與傳代。正常對照組常規(guī)培養(yǎng)；LPS單純處理組加入1μg/mL的LPS處理12h；過表達(dá)空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組、干擾空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組、過表達(dá)質(zhì)粒oe-lncRNA10913轉(zhuǎn)染+LPS處理組、干擾質(zhì)粒sh-lncRNA10913轉(zhuǎn)染+LPS處理組進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24h按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入1μg/mL的LPS處理12h，收集樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)篩選出的NONRATT010913.2序列，利用全基因合成方法得到含特定粘性末端基因序列；將目的載體pLVX-IRES-ZsGreen1進(jìn)行酶切。純化的合成產(chǎn)物與線性化的載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對長出的單克隆先進(jìn)行測序鑒定，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，序列完全正確的即為構(gòu)建成功的目的基因過表達(dá)質(zhì)粒載體，命名為oe-lncRNA10913。利用全基因合成方法，設(shè)計(jì)干擾目標(biāo)序列為TCGATGTCTTCTGTCAA GTTATG，合成含特定粘性末端基因序列；用目的載體pLVXshRNA-EGFP(2A)Puro構(gòu)建干擾質(zhì)粒載體，命名為sh-lncRNA10913。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的NR8383細(xì)胞接種于6孔板，每個培養(yǎng)板接種2×105個細(xì)胞，加入1mL無抗生素培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。將細(xì)胞密度在70%-80%的大鼠NR8383細(xì)胞，離心棄去完全培養(yǎng)基，并用PBS洗去原培養(yǎng)基，加入配備好的Lipofectamine2000稀釋液和各組質(zhì)粒稀釋液組成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集樣本驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 Q-PCR實(shí)驗(yàn) 實(shí)時熒光定量PCR用于檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-10913的表達(dá)。用Takara試劑盒提取試劑嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞中的總RNA。將所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，每20μl反應(yīng)體系取1000ng總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為30℃10min，95℃5min，4℃保存。之后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于RT-qPCR反應(yīng)，配置10μl反應(yīng)體系，采用兩步法，第一步：50℃2min，95℃2min，第二步：95℃15s、60℃1min循環(huán)40次。所有樣品檢測均以GAPDH為內(nèi)參，每組樣品做3個復(fù)孔，所得數(shù)據(jù)以相對定量法按2-△△Ct法進(jìn)行分析。引 物 序 列 如 下：GAPDH F：5`-GGCAAGTTCAAC GGCACAG-3`，GAPDH R：5`-CGCCAGTAGACTC CACGACAT-3`，lncRNA10913 F：5`-GCTTGAACC CTTCGCTACTGC-3`，lncRNA10913 R：5`-CCCTG ACTGTGACCCTCCCT-3`。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將NR8383細(xì)胞分成4組，分為對照組、LPS處理組、過表達(dá)空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組、過表達(dá)質(zhì)粒oelncRNA10913轉(zhuǎn)染+LPS處理組。干擾實(shí)驗(yàn)，將NR8383細(xì)胞分成4組，分為對照組、LPS處理組、干擾空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組、干擾質(zhì)粒si-lncRNA1 0913轉(zhuǎn)染+LPS處理組。采用ELISA試劑盒分別檢測各組NR8383細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的蛋白含量，嚴(yán)格按照說明書步驟及標(biāo)準(zhǔn)操作，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激肺巨噬細(xì)胞后lncRNA的表達(dá)變化利用LPS(1μg/mL)刺激NR8383細(xì)胞，分別于2h，9h后收集細(xì)胞，采用lncRNA高通量測序技術(shù)檢測各組細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA。以LPS 9h刺激組與空白對照組表達(dá)比值≥2倍且FDR≤0.001作為差異表達(dá)lncRNA，相較無LPS刺激組9h組差異表達(dá)的lncRNA共有717條，其中上調(diào)2倍以上的lncRNA共446條，下調(diào)2倍以上的lncRNA共271條（圖1A）。NONRATT010913.2為上調(diào)的差異表達(dá)lncRNA，生物信息學(xué)分析無ORF，不編碼蛋白，命名為lncRNA10913。lncRNA10913的表達(dá)在LPS刺激2h、9h后均有升高，9h組更為明顯（圖1B）。

圖1 LPS刺激肺巨噬細(xì)胞后lncRNA表達(dá)譜的變化

2.2 lncRNA10913促進(jìn)LPS誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá) lncRNA10913在LPS誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞中有差異表達(dá)。LPS刺激AM2h、9h后收集細(xì)胞，Q-PCR檢測不同時間點(diǎn)lncRNA-10913的表達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比，LPS2h組與LPS9h組中l(wèi)ncRNA10913的表達(dá)顯著升高（圖2A）。

lncRNA10913促進(jìn)LPS誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)。構(gòu)建lncRNA10913過表達(dá)質(zhì)粒，QPCR驗(yàn)證過表達(dá)效率。與正常對照組比較，過表達(dá)空載轉(zhuǎn)染組lncRNA10913表達(dá)無明顯差異；與過表達(dá)空載轉(zhuǎn)染組比較，過表達(dá)質(zhì)粒oe-lncRNA10 913轉(zhuǎn)染組的lncRNA10913表達(dá)增加（圖2B）。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，用ELISA分別檢測細(xì)胞上清液的IL-6、TNF-α。結(jié)果顯示與正常對照組比較，LPS處理組TNF-α、IL-6表達(dá)增加；與LPS處理組比較，過表達(dá)空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組TNF-α、IL-6表達(dá)無明顯變化；與過表達(dá)空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組比較，過表達(dá)質(zhì)粒oe-lncRNA10913轉(zhuǎn)染+LPS處理組的TNFα、IL-6表達(dá)升高（圖2C、2D）。

2.3 沉默lncRNA10913抑制LPS誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá) 構(gòu)建sh-lncRNA10913質(zhì)粒，用QPCR驗(yàn)證干擾效率。結(jié)果顯示，與正常組比較，干擾空載轉(zhuǎn)染組lncRNA10913表達(dá)無明顯變化；與干擾空載轉(zhuǎn)染組比較，干擾質(zhì)粒sh-lncRNA10913轉(zhuǎn)染組的lncRNA10913表達(dá)降低（圖3A）。干擾實(shí)驗(yàn)，用ELISA檢測細(xì)胞上清液的IL-6、TNF-α。結(jié)果顯示與正常對照組比較，LPS處理組TNF-α、IL-6表達(dá)增加；與LPS處理組比較，干擾空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組TNF-α、IL-6表達(dá)無明顯變化；與干擾空載轉(zhuǎn)染+LPS處理組比較，干擾質(zhì)粒shlncRNA10913轉(zhuǎn)染+LPS處理組的TNF-α、IL-6表達(dá)降低（圖3B、3C）。

圖2 lncRNA10913促進(jìn)LPS誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)

圖3 沉默lnc RNA10913抑制LPS誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)

3 討論

膿毒癥肺損傷是一種嚴(yán)重的肺部炎癥性疾病，其特征是肺泡毛細(xì)血管膜受到炎性損害并產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[8,9]。炎癥反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子在ALI的發(fā)病過程中起著重要的作用。動物實(shí)驗(yàn)表明，LPS刺激可誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致肺部早期組織病理學(xué)改變[10]，抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是治療ALI的有效方法[11]。我們利用LPS刺激巨噬細(xì)胞NR8383，高通量測序分析RNA的表達(dá)，找出差異表達(dá)的lncRNA。雖然這些lncRNA的差異表達(dá)是受LPS刺激影響產(chǎn)生的，它們對LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是否有調(diào)控作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，但是這種方法能幫助我們找到可能的目標(biāo)分子。

在膿毒癥ALI/ARDS的急性炎癥進(jìn)展以及恢復(fù)期的過程中，肺泡巨噬細(xì)胞對炎癥平衡發(fā)揮著不同的作用[12]，在不同ALI/ARDS的進(jìn)展時期對肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控具有臨床治療意義。在巨噬細(xì)胞中，SIRT1通過沉默lncRNA-CCL2表達(dá)的機(jī)制抑制IL-1β，IL-6和TNF-α等炎癥因子的釋放[13]。趙寧等的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)可以放大LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究也是基于肺泡巨噬細(xì)胞炎癥模型[14]。我們的研究從細(xì)胞模型的建立和lncRNA10913的實(shí)驗(yàn)都基于肺泡巨噬細(xì)胞，對于膿毒癥ALI/ARDS的研究有很好的代表性和實(shí)驗(yàn)意義。當(dāng)然膿毒癥ALI/ARDS的病理過程復(fù)雜，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需要多種細(xì)胞系的驗(yàn)證才更具有說服力，進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)也會讓論證更嚴(yán)謹(jǐn)。

在人類基因組中已經(jīng)鑒定出超過18,000個帶注釋的lncRNA轉(zhuǎn)錄本，但是大多數(shù)lncRNA的功能仍然未知。我們通過高通量測序發(fā)現(xiàn)的lncRNA 10913位于15號染色體，全長693bp。lncRNA109 13在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中有差異表達(dá)。進(jìn)一步通過構(gòu)建質(zhì)粒，以沉默和過表達(dá)lncR NA10913的方式，驗(yàn)證了在肺泡巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRN A10913有調(diào)控炎癥介質(zhì)的作用。lncRNA作為非編碼RNA可以與DNA，RNA，蛋白質(zhì)直接相互作用，能發(fā)揮多樣的調(diào)控功能[15]。有通過炎癥相關(guān)介質(zhì)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的lncRNA-MALAT1[16]，lncRNA-CCL2[13]，有通過miRNA調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的lncRNA-MA LAT1[17]，也有通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路的lncRNAHAGLROS[18]，都參與了膿毒癥急性肺損傷的炎癥反應(yīng)調(diào)控過程。lncRNA10913對炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制沒有明確，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA10 913序列與受體相互作用蛋白激酶3（Ripk3）序列有重疊，lncRNA10913與Ripk3可能存在順式作用的交互。Ripk3在程序性壞死過程中起關(guān)鍵調(diào)控因子的作用，程序性壞死在炎癥性病變、缺血壞死、神經(jīng)退行性病變等方面有重要意義[19]。通過KEGG數(shù)據(jù)庫查詢，也發(fā)現(xiàn)Ripk3是TNF信號通路、壞死信號通路、NOD樣信號通路中的重要分子，這些信號通路在協(xié)調(diào)免疫和炎癥反應(yīng)方面都有著重要的作用。因此推測lncRNA10913可能經(jīng)由TNF信號通路等調(diào)控炎癥反應(yīng)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本研究通過對LPS刺激肺巨噬細(xì)胞模型進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn)lncRNA10913的表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步通過沉默和過表達(dá)lncRNA10913的方式驗(yàn)證了其在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用，證明了沉默lncRNA10913能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為膿毒癥ALI/ARDS的治療提供了可能的方向。

(收稿日期2020-02-13)