HPLC同時測定歸芍疏肝散中芍藥苷 阿魏酸和甘草酸銨的含量

荀秀彪，張順平

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

歸芍疏肝散是曲靖市中醫醫院傳統院內制劑，由柴胡、白芍、白術(炒)、當歸、茯苓、薄荷、甘草(蜜炙)7味藥制得，具有疏肝健脾、養血調經的功效，用于治療肝氣不舒、胸脅脹痛、頭暈目眩、食欲減退、月經不調等癥。其現行質量標準[1]中僅有當歸藥材的定性鑒別，無含量測定，由于處方中白芍為君藥，具有養血調經、柔肝止痛之功效；當歸作為臣藥，具有補血活血、調經止痛之功效；甘草作為使藥，具有調和諸藥之功效[2]。本實驗通過查閱文獻[3-6]和反復摸索，建立了HPLC同時測定歸芍疏肝散中芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨的含量。該方法易操作，專屬性及重復性較好，測定結果準確可靠，可用用于該制劑的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器)；KQ-300UDB型雙頻數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS205DU電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；一體式超純水儀(PURELAB Flex 3，英國ELGA公司)。

1.2 試藥

歸芍疏肝散(規格：6 g/袋，批號分別為：180801、181002、190110、190318、190419)樣品均來自云南省曲靖市中醫醫院；芍藥苷對照品(批號：110736-201741，純度：95.7%)、阿魏酸對照品(批號：110773-201614，純度：99.0%)、甘草酸銨對照品(批號：110731-201619，純度：93.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；甲醇和磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Amethyst C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，15%～85%A；15～40 min，40%～60%A；40～50 min，15%～85%A)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：237 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液制備 分別精密稱取芍藥苷對照品37.54 mg、阿魏酸對照品27.11 mg、甘草酸銨對照品10.37 mg，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得混合對照品儲備溶液(每1 mL中含芍藥苷3.592 6 mg、阿魏酸2.683 9 mg和甘草酸銨0.964 4 mg)，再精密量取上述對照品儲備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度(每1 mL中含芍藥苷0.359 3 mg、阿魏酸0.268 4 mg和甘草酸銨0.096 44 mg)，即得混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取裝量差異項下的內容物，研細，取約2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇35 mL超聲提取30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，續濾液再用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3陰性樣品溶液制備 根據制劑處方及工藝，分別制備缺當歸、缺白芍和缺甘草的3份陰性樣品(由云南省曲靖市中醫醫院提供)，再按2.2.2項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 結果

2.3.1專屬性試驗 在上述色譜條件下，分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。結果表明，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨分離較好，無干擾，說明測定方法專屬性較好。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.缺白芍陰性對照品；D.缺當歸陰性對照品；E.缺甘草陰性對照品；1.芍藥苷；2.阿魏酸；3.甘草酸銨。圖1 歸芍舒肝散HPLC圖

2.3.2線性關系試驗 精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別重復進樣3次，記錄峰面積。以進樣量(X)為橫坐標，峰面積平均值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，芍藥苷：Y=7 805.308 2X+28.913 0，r=0.999 8；阿魏酸：Y=4 281.078 1X-18.378 5，r=0.999 9；甘草銨酸：Y=3 219.337 9X-2.610 0，r=0.999 8。結果表明，芍藥苷進樣量在0.359 3～5.388 9 μg，阿魏酸進樣量在0.268 4～0.402 6 μg，甘草酸銨進樣量在0.096 44～0.144 7 μg線性關系良好。

2.3.3檢測限和定量限 取2.2.1項下的混合對照品溶液適量，等倍逐級稀釋，進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3∶1時，得檢測限分別為：芍藥苷0.31 ng、阿魏酸0.71 ng、甘草酸銨1.02 ng；當信噪比為10∶1時，得定量限分別為：芍藥苷1.01 ng、阿魏酸2.13 ng、甘草酸銨3.11 ng。

2.3.4穩定性試驗 取經2.2.1項方法制備(批號：190110)供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進行分析，分別在0、4、8、16、36、48 h進樣測定。結果芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨峰面積RSD分別為0.36%、0.42%和0.31%。結果表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.3.5回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品(批號：190110)9份，每份約1.0 g，分別精密加入低、中、高3種不同濃度(相當于供試品溶液濃度的50%、100%、150%)的混合對照品溶液，分別按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，每個濃度制備3份，按照2.1項下的色譜條件進行分析，結果見表1。

表1 歸芍疏肝散中3種成分回收率試驗結果(n=9)

2.3.6精密度試驗 精密取經2.2.1項方法制備的樣品(批號：190110)供試品溶液10 μL，按照2.1項下的色譜條件進行分析，連續6次。結果芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.30%、0.21%、0.14%，結果表明儀器平行精密度良好。

2.3.7重復性試驗 精密稱取樣品(批號：190110)6份，每份2.0 g。按2.2.1項下的方法制備供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進行分析，每1 g樣品中含芍藥苷7.230 2 mg，RSD為0.26%；含阿魏酸6.011 2 mg，RSD=0.36%；含甘草酸銨4.623 6 mg，RSD=0.31%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.8樣品測定 取樣品5批次(批號分別為：180801、181002、190110、190318、190419)，分別按2.2.1項下的方法制備供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進行分析，樣品中芍藥苷、阿魏酸、和甘草酸銨的含量結果見表2。

表2 歸芍疏肝散供試品含量測定結果(n=5)

3 討論

3.1 檢測成分選擇

白芍、當歸、甘草為處方中的主要藥效藥材，現行標準中尚無對其含量進行測定。因此，本實驗選取方中的有效成分芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨進行定量測定分析研究。單獨對芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨進行定量分析已有相關報道[7-9]，本實驗采用一測多評法同時測定芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨3個成分含量，更能有效控制其質量。

3.2 提取條件選擇

實驗中曾采用70%甲醇、甲醇-水、乙醇等溶媒進行提取，結果發現，甲醇效果最好；采用直接超聲提取、索氏提取、加熱回流提取方法提取3 h，發現三者差異不大；再比較超聲提取15、30、45、60 min，發現超聲30 min后提取效率沒有明顯提高。綜合考慮，選擇提取方法為甲醇超聲提取30 min。

3.3 分離條件選擇

本實驗曾采用了3種方法進行成分分離[10-13]：1)乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫；2)甲醇-水梯度洗脫；3)乙腈-0.1%冰醋酸梯度洗脫，結果發現第二種方法檢測不到阿魏酸，采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫保留時間合適且各成分獲得較好的分離。

3.4 檢測波長選擇

參考《中華人民共和國藥典》及相關文獻[14-16]，分別在230、237、275、316 nm波長下進行測定考察，結果發現在237 nm下芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨均能獲得較好的信號響應。

3.5 小結

本實驗中采用了多波長對芍藥苷、阿魏酸和甘草酸銨進行測定，由于多波長對儀器要求較高，且在237 nm波長下能達到較好效果，因此最終選擇單波長進行測定；對梯度洗脫的選擇進行了多次實驗，亦是本實驗實現3個成分同時測定的關鍵因素，隨著技術的不斷發展，今后可能探索更多成分的同時測定。