基于UPLC-MS/MS對木蝴蝶配方顆粒6種成分含量測定及特征圖譜研究△

何民友，魏梅，程學仁，王利偉，吳淑珍，索彩仙，李國衛

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

木蝴蝶為紫葳科木蝴蝶屬木蝴蝶Oroxylumindicum(L) Vent.的干燥成熟種子[1]。木蝴蝶始載于《滇南本草》，原名千張紙，《本草綱目拾遺》始名木蝴蝶[2]。其味苦、甘，涼，入肺、肝、胃經，有清肺利咽、疏肝和胃之功效。已有的文獻報道[3]中指出，在木蝴蝶成熟種子中含有大量具有生物活性的黃酮類化合物，如黃芩苷、黃芩苷元、白楊黃素、槲皮素等?，F代藥理醫學研究表明，木蝴蝶具有抗炎、抗氧化、抗癌、降糖、抑制病毒及腫瘤生長等多種藥理作用[4-9]。具有藥理活性化學成分脂肪油、黃芩苷元-7-葡萄糖苷、黃芩苷、黃芩苷元、千層紙素A、木蝴蝶苷B、白楊素、白楊素-7-葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物[10]。

木蝴蝶配方顆粒是木蝴蝶飲片經水提取后制粒而成，供臨床調配組成復方湯劑使用，具有免煎易服、水沖即溶、攜帶方便、劑量準確等特點。目前國內外關于木蝴蝶配方顆粒的化學成分和藥理的文獻較少，且還沒有建立利用某些特征性的化學成分對木蝴蝶配方顆粒進行客觀評價和質量控制的方法。通過文獻研究[11-13]發現，關于木蝴蝶黃酮類成分含量測定的報道多以槲皮素、木蝴蝶苷B、黃芩苷和黃芩素等成分測定為主，因各化學成分最大吸收波長不一，要實現一法測定多指標成分含量需通過全時段多波長融合來實現[14]。黃酮類化合物在植物體內大部分與不同的糖結合成苷，其結構復雜多樣，不易測定。常用黃酮類物質測定方法有分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法。分光光度法測定由于雜質干擾嚴重，導致準確性差，難重現；高效液相色譜法對分離度要求高[15]。基于此，本實驗在參考文獻[16-17]的基礎上，建立高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS)同時測定該類物質的方法，能有效快速測定木蝴蝶配方顆粒中6種黃酮類化學成分的含量；同時，本實驗還建立木蝴蝶配方顆粒特征圖譜，為中藥木蝴蝶的多指標質量控制和較全面質量評價奠定基礎。

UPLC-MS是目前廣泛應用的分析方法之一。它利用液相色譜的高效分離能力對分析物進行分離，再以質譜為檢測器使待測化合物產生氣態離子，再按m/z將離子分離，檢測。UPLC-UV-MS能充分發揮色譜的分離能力，并具有質譜的高分辨特性，可得到保留時間、紫外響應、荷質比響應這樣的三維信息，適合分析中藥多組分復雜體系。本實驗選取木蝴蝶配方顆粒中黃酮類指標性的代表成分白楊素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黃芩素、黃芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B 6種成分，以超高效液相-串聯質譜(UPLC-MS/MS)為監測平臺，利用多反應選擇性檢測(MRM)的方法進行檢測，該方法快速、準確、抗干擾力強，建立快速可靠的定量檢測方法，通過特征圖譜為全面有效控制木蝴蝶配方顆粒的質量提供技術支撐。

1 材料

1.1 儀器

Waters 液質聯用儀(液相部分ACQUITY UPLC H-Class、質譜部分Waters Xevo TQD MS)；百萬分之一天平(METTLER TOLEDO，XP26)；萬分之一天平(METTLER TOLEDO，ME204E)；電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司，HWS-28)；數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ500DE)；超純水系統(默克股份有限公司，Milli-Q-Direct)。

1.2 試藥

白楊素對照品(批號：111701-200501，純度：100%)、木蝴蝶苷B對照品(批號：111915-201603，純度：91.9%)、黃芩苷對照品(批號：110715-201720，純度：93.5%)、黃芩素對照品(批號：111595-201607，純度：98.5%)購自中國食品藥品檢定研究院；白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對照品(批號：wkq17072702，純度：98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司；木蝴蝶苷A對照品(批號：17021703，純度：98%)購自成都普菲德生物技術有限公司；乙腈(德國merck公司，色譜純)；乙醇、甲醇(西隴科學股份有限公司，分析純)；磷酸、甲酸(天津科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；水為實驗室自制水。

16批木蝴蝶配方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產，均來自供應商，經廣東一方制藥有限公司質量部檢測均符合2015年版《中華人民共和國藥典》木蝴蝶項下要求。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫(0～10 min，10%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～28 min，20%～35%A；28～33 min，35%～65%A；33～40 min，65%A)；流速為0.28 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣體積為1 μL；檢測波長為276 nm。

2.2 質譜條件

色譜柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動相A，以0.01%甲酸為流動相B，梯度洗脫(0～10 min，10%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～28 min，20%～35%A；28～33 min，35%～65%A；33～40 min，65%A)；柱溫為30 ℃；流速為0.28 mL·min-1；檢測波長為276 nm。

電噴霧離子源(ESI+)，噴霧電壓為1.55 kV；脫溶劑溫度為597 ℃，離子源溫度為148 ℃；脫溶劑氣流為997 L·hr-1；氮氣流為1 L·hr-1。質譜掃描采用多反應檢測(MRM)掃描模式。Cone參數和Collision質譜參數優化通過蠕動針泵注射的方法調諧各標準化合物。所得參數見表1，最終得到的液相紫外圖譜和質譜提取離子流圖分別見圖1～2。

表1 LC-MS檢測木蝴蝶配方顆粒標準化合物的質譜參數

注：*定量離子。

注：A.對照品；B.木蝴蝶配方顆粒。圖1 對照品和木蝴蝶配方顆粒色譜圖

注：A.木蝴蝶苷B；B.黃芩苷；C.木蝴蝶苷A；D.白楊素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷；E.黃芩素；F.白楊素。圖2 木蝴蝶配方顆粒供試品總離子流圖

2.3 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B對照品適量，加甲醇溶解定容至25 mL，即得白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷、木蝴蝶苷B質量濃度分別為12.594、69.600、32.286、128.256、31.512、60.276 μg·mL-1的混合對照品儲備液，于4 ℃保存，備用。

2.4 供試品溶液制備

取木蝴蝶配方顆粒適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率：300 W，頻率：40 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

3 含量測定結果

3.1 方法學考察

3.1.1精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成含白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷、木蝴蝶苷B質量濃度分別為6.297、34.800、16.143、64.128、15.756、30.138 μg·mL-1的對照品溶液，上述色譜條件下連續進樣6次，考察精密度，峰面積RSD見表2，結果RSD<3%，表明儀器精密度良好。

3.1.2線性關系 精密量取混合對照品溶液，按稀釋倍數為1、1.2、1.5、2、3、6依次逐級稀釋，定容，制得6個濃度梯度的系列混合對照品溶液，按照2.2中的質譜條件測定，以峰面積對進樣量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線，求得各成分回歸方程、r、線性范圍，見表3，結果顯示6個成分的線性關系良好。

3.1.3重復性試驗 取同一批木蝴蝶配方顆粒(批號：8016072)，按照供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按照上述色譜和質譜條件進行平行測定，測得白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B的含量及相應的RSD，見表2，實驗結果顯示本方法重復性良好。

3.1.4穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h后進樣，測定峰面積，峰面積RSD見表2，實驗結果顯示供試品溶液在12 h內穩定性良好。

3.1.5加樣回收率 精密稱取已知含量的木蝴蝶配方顆粒(批號：8016072)共6份，分別精密加入一定量的對照品溶液，按照2.4中供試品溶液的制備方法及2.2中的質譜條件測定，計算白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B的回收率，見表2，結果表明加樣回收率良好。

3.1.6含量測定 按照2.4中供試品溶液的制備方法及2.2中的質譜條件測定，計算木蝴蝶配方顆粒中的白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B 6種成分的含量，結果見表4。

表2 木蝴蝶配方顆粒方法學考察結果匯總

表3 木蝴蝶配方顆粒中6個成分的線性關系考察結果

表4 16批木蝴蝶配方顆粒含量測定結果(n=2) mg·g-1

4 特征圖譜測定結果

4.1 方法學考察

4.1.1精密度試驗 取含量測定項下供試品溶液，進樣6次，每次1 μL，比較不同色譜峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，分別為0.06%～0.09%、0.10%～0.37%。結果表明該方法精密度好，符合特征圖譜檢測要求。

4.1.2重復性試驗 取同一批木蝴蝶配方顆粒(批號：8016072)，按照供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，進樣量為1 μL，比較不同色譜峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，分別為0.08%～0.10%、0.03%～1.99%。結果表明該方法重復性好，符合特征圖譜檢測要求。

4.1.3穩定性試驗 取含量測定項下供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12 h進樣，每次進樣1 μL，比較不同色譜峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，分別為0.10%～0.16%、0.04%～1.32%。結果表明該方法穩定性好，符合特征圖譜檢測要求。

4.1.4特征圖譜峰指認 精密吸取白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷、木蝴蝶苷B混合對照品溶液，上述色譜條件下進樣，得木蝴蝶配方顆粒對照圖譜，見圖3。

4.1.5特征圖譜建立與特征峰 取16批木蝴蝶配方顆粒樣品，按照2.4項下的方法制備供試品溶液，進樣1 μL，測定得色譜圖(見圖4)。將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”進行數據處理，設定S1為參照圖譜，與其他樣品的色譜圖自動匹配，生成木蝴蝶配方顆粒特征圖譜(見圖5)。分別計算16批木蝴蝶配方顆粒樣品的相似度，見表5，16批木蝴蝶配方顆粒相似度均大于0.90，說明木蝴蝶配方顆?；瘜W成分一致性較好，質量比較穩定。

圖3 木蝴蝶配方顆粒UPLC對照圖譜

圖4 16批木蝴蝶配方顆粒UPLC特征圖譜

注：1.木蝴蝶苷B；2.黃芩苷；3.木蝴蝶苷A；4.白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；5.黃芩素；6.白楊素。圖5 木蝴蝶配方顆粒UPLC特征圖譜共有模式圖

表5 16批木蝴蝶配方顆粒相似度

序號相似度序號相似度10.99790.99920.998100.99930.999110.99940.998120.99850.998130.99360.999140.99970.998150.99981.000160.997

以1號峰為參照峰，標示出木蝴蝶配方顆粒超高效液相紫外色譜圖中的6個共有峰，共有峰的峰面積之和>90%。計算各色譜峰與參照峰相對保留時間的RSD。結果表明，樣品各色譜圖共有峰的相對保留時間RSD均<3.0%；而相對峰面積的RSD相差較大，見表6～7。

表6 16批木蝴蝶特征圖譜共有峰的相對保留時間

表7 16批木蝴蝶特征圖譜共有峰的相對峰面積

5 討論

文獻分析研究顯示[18]，木蝴蝶藥材中主要含有的黃酮類成分有白楊素、木蝴蝶苷B、黃芩素、黃芩苷、木蝴蝶苷A、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等黃酮類成分及多種黃酮苷元。本研究對木蝴蝶配方顆粒中黃酮類化學成分進行研究，根據精確相對分子質量、相關文獻、對照品色譜保留時間及二級譜圖，得到標準化合物的質譜參數，建立木蝴蝶配方顆粒中化學成分含量的快速檢測方法，并建立木蝴蝶配方顆粒特征圖譜；與木蝴蝶藥材研究文獻相比，所建立的方法能更多地檢測木蝴蝶配方顆粒中的黃酮類指標，且快速有效檢測化學成分含量，通過特征圖譜能對性狀完全改變后的木蝴蝶快速鑒別，為其質量評價方法和化學成分的深入研究提供依據。

實驗中對色譜條件和質譜條件進行了優化，對不同提取溶劑、不同提取方式、不同提取時間及不同料液比進行考察，以色譜峰信息量最大化、提取效率最高、方法穩定作為指標，最終確定以70%乙醇作為提取溶劑，超聲處理(功率：300 W，頻率：40 kHz)30 min，0.1∶50料液比作為樣品的制備方法；對色譜條件中的色譜柱進行考察，經比較發現，Agilent SB C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)柱分離效果最好，峰形更好；特征圖譜研究過程采用二極管陣列檢測器對樣品進行全波長掃描，發現在276 nm處基線穩定，各峰峰面積較高，因此，檢測波長定為276 nm；對流動相中水相進行考察，通過對比乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%乙酸、乙腈-%甲酸及不同酸濃度對各色譜峰的影響，結果使用乙腈-0.1%磷酸各色譜峰分離效果最好，因質譜不能使用有機鹽流動相，改用0.01%甲酸為水相后各色譜峰分離效果一致，通過耐用性考察發現，柱溫和流速微小的變動能滿足系統適應性要求。

本實驗建立了木蝴蝶配方顆粒UPLC特征圖譜方法，確定并指認了6各特征峰，較為全面地反映木蝴蝶黃酮類成分的特點。本研究與目前研究文獻相比[19-20]：同樣的分析時間條件下各色譜峰分離效果較好，且峰數較多；同樣的分離效果條件下，有分析時間較短的優點。目前暫沒有對木蝴蝶配方顆粒特征圖譜的研究，本研究為今后木蝴蝶配方顆粒的研究提供參考。

中藥配方顆粒是在中醫藥理論指導下，采用符合炮制規范的飲片為原料，以水作為提取溶媒，經過提取、過濾、濃縮、干燥、制粒等現代化生產工藝制備得到的供臨床配方使用的顆粒制劑。其作為傳統飲片有效替代，供臨床辨證論治、隨證加減、配方使用，與傳統中藥飲片相比，中藥配方顆粒既保留了原中藥飲片的藥性、藥味和藥效，又具有不需煎煮、療效確切、安全方便等優點，是“源于飲片，高于飲片”的現代中藥新型湯劑。早于1993年，在國家科委、國家中醫藥管理局的帶領下正式開展中藥飲片劑型的改革，開始中藥配方顆粒的研發和試點生產。2001年國家藥監局頒發國家藥監注〔2001〕325號文：“中藥配方顆粒管理暫行規定”，并先后發文批準了6家企業為中藥配方顆粒試點生產單位。但目前暫未對配方顆粒質量標準起草說明，本研究通過對木蝴蝶配方顆粒的質量研究，為木蝴蝶配方顆粒后續研究提供技術支持。

本實驗采用UPLC-MS/MS技術對木蝴蝶配方顆粒黃酮類6種主要化學成分進行了快速定性及定量分析，研究結果發現，各批次間含量有一定的差異，由于藥材受到產地、采收期及儲存條件等因素影響，同時，生產工藝控制點及控制量的差異，也會造成產品含量的差異，因此，應嚴格控制原藥材的質量，按照工藝規定操作控制，確保產品質量的穩定可控，以保證藥品安全、有效。