利用柱前在線衍生-高效液相色譜法測(cè)定培植牛黃及天然牛黃中18種氨基酸的含量

溫浩然，冀艷華，韓星，呂寶俊，汪國鵬，劉洋*，唐雙喜

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.尚藥局制藥有限公司，寧夏 銀川 750004； 3.島津公司，北京 100020；4.中財(cái)瀚熙(北京)生物科技發(fā)展有限公司，北京 101503

培植牛黃為牛科動(dòng)物牛BostaurusdomesticusGmelin的活體膽囊中培植的干燥膽結(jié)石。手術(shù)或宰殺時(shí)，帶核取出，除去膽汁及黏液，干燥，去核。具有清心、豁痰、開竅、涼肝、息風(fēng)、解毒等功效[1]。臨床用于解熱鎮(zhèn)痛抗炎，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)具有抗氧化、抗病原微生物及抗腫瘤作用。牛磺酸最早是由牛黃中分離得到的具有抗疲勞、解熱鎮(zhèn)痛等作用的成分，又名牛膽堿、氨基乙磺酸、2-氨基乙磺酸，是中藥及保健食品中的重要指標(biāo)性成分[2]，在培植牛黃中牛磺酸含量較高。

長(zhǎng)期以來，我國天然牛黃藥源緊缺，遠(yuǎn)不能滿足臨床用藥需求，為擴(kuò)大藥用資源，科研工作者對(duì)牛黃的活性成分進(jìn)行了大量的研究。在我國科研工作者的努力下其替代品人工牛黃、體外培育牛黃和培植牛黃應(yīng)運(yùn)而生，并得以廣泛應(yīng)用[3]。其中牛黃、人工牛黃及體外培育牛黃的標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部，培植牛黃則收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第七冊(cè)[4]。對(duì)培植牛黃的成分、藥理等有人已做了一些研究，氨基酸也是其中不可忽視的有效成分[5]。目前氨基酸分離主要采用高效液相色譜法，已有逐漸取代氨基酸自動(dòng)分析儀的趨勢(shì)[6]。本研究采用鄰苯二甲醛和9-芴甲基氯甲酸酯(OPA-FMOC)柱前衍生化-高效液相色譜法對(duì)培植牛黃中18種氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，以期為培植牛黃的研究及質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津SHIMADZU LC-16高效液相色譜儀(包括DGU-20A脫氣機(jī)、LC-16二元高壓泵、SIL-16自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-16柱溫箱、SPD-16紫外檢測(cè)器)；色譜柱為AJS-02氨基酸分析專用柱C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)；BSA124S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；XD-DCY-24Y水浴氮吹儀(上海析達(dá)儀器有限公司)；DZ-2BC真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-S4A恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；SIGMA臺(tái)式高速離心機(jī)(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；METTLER TOLEDO FiveEasy Plus pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

培植牛黃(批號(hào)分別為：20170901、20170903、20170107)由尚藥局(寧夏)股份有限公司提供，培植牛黃(批號(hào)分別為：Y9205、Y9305、Y9401)由云南牛黃學(xué)研究所生產(chǎn)，培植牛黃(批號(hào)分別為：H9301、H951001、H940903)由河南省洛陽市瀍河?xùn)|方培植牛黃研究所生產(chǎn)；天然牛黃(批號(hào)：0149001)購于北京同仁堂大柵欄店。

17種氨基酸混合標(biāo)樣(島津公司AJS-01氨基酸柱前衍生化方法包，批號(hào)：20161123)：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)；2種內(nèi)標(biāo)氨基酸(島津公司AJS-01氨基酸柱前衍生化方法包，批號(hào)：AA-N，G4344V01)：正纈氨酸(Nva)、肌氨酸(Sar)；牛磺酸(中國食品藥品檢定研究院，含量：100.0%)；OPA衍生試劑(島津公司AJS-01氨基酸柱前衍生化方法包，批號(hào)：AA-OA，G4344V01)、FMOC衍生試劑(島津公司AJS-01氨基酸柱前衍生化方法包，批號(hào)：F8404V01)、硼酸鹽緩沖液(島津公司AJS-01氨基酸柱前衍生化方法包，批號(hào)：B0801B01)；十二水合磷酸氫二鈉(批號(hào)：150307，西隴化工股份有限公司)；十水合四硼酸鈉(批號(hào)：20170308，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司)；鹽酸為分析純(北京化工集團(tuán)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為AJS-02氨基酸分析專用柱(C18，150 mm×4.6 mm，3 μm)；以0.016 mol·L-1磷酸氫二鈉-四硼酸鈉緩沖液(pH 8.2)為流動(dòng)相A，以甲醇-乙腈-水(9∶9∶2)為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm(一級(jí)氨基酸)和262 nm(二級(jí)氨基酸)；柱溫50 ℃；流速1.6 mL·min-1；進(jìn)樣量2 μL。

表1 培植牛黃氨基酸樣品梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取牛磺酸對(duì)照品適量，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液制成每1 mL含1.65 mg牛磺酸對(duì)照品的溶液，作為牛磺酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，放入2 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，移液槍精密加入上述儲(chǔ)備液50 μL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和0.1 mol·L-1鹽酸溶液350 μL至550 μL搖勻，即得。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品最終質(zhì)量濃度見表2。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品最終質(zhì)量濃度

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過六號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置水解管中，加入6 mol·L-1鹽酸10 mL，緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)饬?0 min，密閉封口，置烘箱中150 ℃水解1 h，取出，放冷至室溫，過濾。精密量取續(xù)濾液5.0 mL，置蒸發(fā)皿中，于80 ℃水浴蒸干，殘?jiān)?.1 mol·L-1鹽酸溶液6 mL，分3次洗滌，洗液并入10 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液200 μL，放于2 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，移液槍精密加入稀釋5倍后的內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，再加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液300 μL至550 μL，搖勻，即得。

2.4 衍生化試劑的配置

2.4.1OPA衍生試劑 取OPA衍生試劑A液1支，加入OPA衍生試劑B液60 μL，搖勻，放入2 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶中即得。

2.4.2FMOC衍生試劑 在試劑盒中取FMOC衍生試劑200 μL于裝上內(nèi)襯管的2 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶中即可。

2.5 衍生方法

利用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行在線自動(dòng)衍生化處理，為島津AJS-1固定程序。衍生程序：1)吸取硼酸鹽緩沖液5 μL；2)吸取測(cè)定溶液(對(duì)照品溶液或供試品溶液) 2 μL；3)以15 μL·s-1速度吸、吐7 μL空氣5次；4)水洗針；5)吸取OPA衍生劑1 μL；6)以15 μL·s-1速度吸、吐8 μL空氣6次；7)等待0.5 min；8)水洗針；9)吸取FMOC衍生劑1 μL；10)以15 μL·s-1速度分別吸、吐9 μL空氣3次，吸、吐15 μL空氣4次；11)等待0.5 min；12)50%乙腈洗針；13)吸取稀釋劑10 μL；14)以15 μL·s-1速度吸、吐25 μL空氣8次，衍生后的樣品注入液相色譜儀。

2.6 計(jì)算公式

供試品中總氨基酸含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X)計(jì)，單個(gè)氨基酸以Xi計(jì)，數(shù)值以%表示，依次按公式(1)和(2)計(jì)算。

(1)

X=∑Xi

(2)

式中：X為供試品中總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；Xi為供試品中單個(gè)氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；Axi為供試品溶液中單個(gè)氨基酸的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值；Asi為對(duì)照品溶液中單個(gè)氨基酸的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值；Ci為對(duì)照品溶液中對(duì)應(yīng)氨基酸峰的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；Vi為供試品溶液稀釋體積倍數(shù)(mL)；mi為折干后供試品質(zhì)量(mg)。

3 氨基酸含量測(cè)定方法學(xué)考察

3.1 專屬性考察

分別精密量取0.1 mol·L-1鹽酸溶液、稀釋5倍后的氨基酸混合標(biāo)樣加內(nèi)標(biāo)和培植牛黃供試品溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)島津AJS-01氨基酸柱前衍生化方法包所提供數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)摸索，確定雙通道檢測(cè)波長(zhǎng)分別為338、262 nm，記錄色譜圖(見圖1～3)。結(jié)果表明，在0.1 mol·L-1鹽酸溶液及供試品中其他色譜峰不干擾18個(gè)氨基酸的測(cè)定，均達(dá)到檢測(cè)限，且分離度良好。

3.2 精密度試驗(yàn)

取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品100 μL于2 mL進(jìn)樣瓶中，移液槍精密加入牛磺酸對(duì)照品儲(chǔ)備液50 μL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和0.1 mol·L-1鹽酸溶液350 μL，搖勻，即得。連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。結(jié)果對(duì)照品溶液中18個(gè)氨基酸峰面積的RSD<2.0%，氨基酸峰保留時(shí)間的RSD<1.0%，表明精密度良好。

3.3 線性關(guān)系考察

配置不同濃度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別精密量取各線性溶液2 μL注入液相色譜儀。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表3。

注：A.指檢測(cè)波長(zhǎng)λ=338 nm 對(duì)應(yīng)檢測(cè)氨基酸；1.Asp；2.Glu；3.Ser；4.His；5.Gly；6.Thr；7.Arg；8.Tau；9.Ala；10.Tyr；11.Cys；12.Val；13.Met；14.Nva；(內(nèi)標(biāo)1)；15.Ile；16.Phe；17.Lys；18.Leu；B.指檢測(cè)波長(zhǎng)λ=262 nm對(duì)應(yīng)檢測(cè)氨基酸；1.Sar(內(nèi)標(biāo)2)；2.Pro；下同。圖1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液HPLC圖

圖2 培植牛黃供試品溶液HPLC圖

圖3 空白溶液HPLC圖

表3 18種氨基酸的線性關(guān)系

氨基酸名稱線性范圍/μg·mL-1線性方程rAsp0.67～66.55Y=0.010 7X-0.002 51.000 0Glu0.74～73.57Y=0.010 0X+0.001 00.999 9Ser0.53～52.55Y=0.013 8X+0.004 90.999 9His2.33～77.58Y=0.005 5X-0.004 30.999 5Gly0.38～75.08Y=0.026 8X-0.016 30.999 6Thr0.60～59.56Y=0.013 4X+0.029 10.999 5Arg0.87～87.10Y=0.011 1X+0.001 60.999 9Tau0.12～600.00Y=0.036 3X+0.123 30.999 5Ala0.45～89.10Y=0.022 2X+0.015 60.999 8Tyr0.91～90.60Y=0.010 8X+0.001 70.999 9Cys0.60～60.08Y=0.012 1X+0.017 90.999 5Val0.59～117.16Y=0.020 4X-0.012 20.999 9Met0.75～74.61Y=0.016 9X+0.015 20.999 9Ile0.66～65.59Y=0.016 4X+0.014 60.999 5Phe0.83～82.60Y=0.012 3X+0.004 40.999 8Lys0.73～73.10Y=0.019 3X+0.037 70.989 1Leu0.66～65.59Y=0.015 0X+0.000 90.999 8Pro1.73～57.57Y=0.011 3X-0.017 50.999 9

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品粉末(過六號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置水解管中，按照2.3制備供試品溶液6份。總氨基酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.33%，RSD為1.9%；牛磺酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.8%，RSD為2.0%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。見表4。

3.5 中間精密度

在不同的檢查日期，按照3.4重復(fù)性試驗(yàn)方法，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份樣品的總氨基酸和牛磺酸含量，并計(jì)算含量的RSD。得總氨基酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.1%，RSD為2.7%；牛磺酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.6%，RSD為2.8%。結(jié)果表明該測(cè)定方法精密度良好，見表4。

表4 18種氨基酸重復(fù)性及中間精密度試驗(yàn)結(jié)果 %

3.6 溶液穩(wěn)定性考察

供試品溶液放置于室溫(20～25 ℃)，分別于0、4、8、12、24、48 h量取2 μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明本品氨基酸含量測(cè)定供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，氨基酸色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD在10%以內(nèi)，保留時(shí)間RSD在3%以內(nèi)，穩(wěn)定性較好。

3.7 回收率試驗(yàn)

取本品粉末(過六號(hào)篩)約0.1 g，共6份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品0.4 mL和牛磺酸對(duì)照品(質(zhì)量濃度為2.05 mg·mL-1)3.0 mL，按2.3供試品溶液制備的方法制備供試品溶液，測(cè)定。根據(jù)所得峰面積計(jì)算18 種氨基酸的平均回收率(n=6)(RSD) 分別為Asp 99.9%(2.7%)，Glu 98.9%(2.9%)，Ser 98.0%(2.7%)，His 93.7%(1.1%)，Gly 102.0%(3.3%)，Thr 95.2%(1.9%)，Arg 102.0%(2.3%)，Tau 103.6%(5.6%)，Ala 102.0%(3.3%)，Tyr 93.5%(2.4%)，Cys 103.4%(4.6%)，Val 97.1%(3.2%)，Met 100.7%(1.9%)，Ile 104.1%(2.8%)，Phe 101.4%(3.9%)，Lys 99.6%(2.0%)，Leu 102.6%(3.4%)，Pro 98.7%(2.5%)。

3.8 培植牛黃樣品測(cè)定及結(jié)果

取本品粉末(過六號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，按2.3制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算氨基酸含量。10批牛黃樣品中氨基酸測(cè)定結(jié)果見表5。

4 討論

由于柱前衍生-HPLC測(cè)定氨基酸的含量，會(huì)由于衍生試劑或衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，導(dǎo)致衍生過程難以保證快速、均一、穩(wěn)定。本研究方法利用現(xiàn)有儀器，通過控制自動(dòng)進(jìn)樣器按預(yù)先設(shè)定的程序，完成在線衍生功能。以O(shè)PA和FMOC為衍生試劑，衍生后直接注入液相色譜儀進(jìn)行分析，有效消除了離線衍生因進(jìn)樣時(shí)間不同和手工操作速度慢、不均一等造成的誤差，既提高了準(zhǔn)確性，也簡(jiǎn)化了操作過程及工作強(qiáng)度[7]。

OPA和FMOC是常用的衍生化試劑，OPA不能與仲氨基酸反應(yīng)，將兩者聯(lián)合運(yùn)用，可以使OPA先與伯氨基酸反應(yīng)后，F(xiàn)MOC再與仲氨基酸反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)[8]。為了保證衍生反應(yīng)的迅速和完全進(jìn)行，OPA和FMOC 衍生劑均采用過量加入，本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，為使衍生化反應(yīng)完全，對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度(20、30 mg·mL-1)進(jìn)行了考察，最終選擇了20 mg·mL-1。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品的制備方法進(jìn)行考察。因水解時(shí)間對(duì)氨基酸的測(cè)定結(jié)果影響巨大，根據(jù)文獻(xiàn)的研究，一般150 ℃條件下水解1 h可以將結(jié)合氨基酸全部水解為游離型氨基酸。筆者對(duì)文獻(xiàn)常用的水解時(shí)間(30、60、90 min)條件進(jìn)行考察，為了確保培植牛黃藥材中結(jié)合型氨基酸全部被水解，故選擇水解60 min；同時(shí)也考察了氮吹時(shí)間0、5、10、15 min的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氮吹時(shí)間對(duì)總氮基酸和牛磺酸的含量測(cè)定結(jié)果略有影響，氮吹10 min和15 min均可保證排除水解管中殘留氧氣對(duì)氨基酸的破壞，因此，選擇氮吹時(shí)間為10 min即可。

表5 10批牛黃樣品中氨基酸的含量測(cè)定 %

作為天然牛黃代用品，目前市場(chǎng)上人工牛黃及體外培育牛黃應(yīng)用范圍較廣，并且已收載于《中華人民共和國藥典》。從氨基酸含量的角度來看，人工牛黃現(xiàn)用方是含膽紅素0.7%、去氧膽酸15%、豬膽酸15%、牛羊膽酸12.5%、膽固醇2%、無機(jī)鹽5%以及多量淀粉的混合物[9]，并不包含氨基酸成分。在測(cè)定批次的牛黃里，培植牛黃中總氨基酸含量接近天然牛黃，且牛磺酸占總氨基酸含量的均值，為57.49%，遠(yuǎn)高于天然牛黃中牛磺酸含量，因此培植牛黃作為天然牛黃代用品，從成分含量的角度來看，有巨大潛力。

綜上，培植牛黃中氨基酸含量高于人工牛黃，接近天然牛黃，且牛磺酸含量更高，而牛磺酸具有對(duì)部分牛磺結(jié)合型膽汁酸形成、滲透壓調(diào)節(jié)、增強(qiáng)免疫力和抗心律失常等方面的重要藥理作用[10]。