丹參藥材商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量評(píng)價(jià)△

方文韜，鄧愛平，康利平，南鐵貴，唐金富，張燕，趙玉洋， 李青苗，任振麗，郭蘭萍，黃璐琦，詹志來(lái)*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 3.四川省中藥科學(xué)院，四川 成都 610041； 4.山東丹紅制藥有限公司，山東 菏澤 274000

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，為常用大宗中藥材，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有抗血栓、改善微循環(huán)、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[3]。丹參不但在飲片調(diào)劑中用量大，而且是眾多活血類制劑的原料，因此年需求量極大。《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》(1984年頒布實(shí)施)中丹參商品規(guī)格分為“丹參(野生)”和“川丹參(家種)”2個(gè)規(guī)格，其中野生規(guī)格只有統(tǒng)貨，川丹參規(guī)格下根據(jù)主根上中部直徑大小分為2個(gè)等級(jí)[4]。由于丹參的需求量大，野生丹參已難滿足市場(chǎng)需求，加之栽培技術(shù)的發(fā)展，目前市場(chǎng)均為栽培丹參，川丹參多供出口。近年來(lái)，丹參栽培面積不斷擴(kuò)大，山東、河南、河北、山西、陜西、四川等省均有大面積種植，商品規(guī)格較多。當(dāng)前丹參的規(guī)格多，部分產(chǎn)區(qū)等級(jí)劃分較細(xì)，原有的商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)已不能反映現(xiàn)狀，因此丹參的商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)需要調(diào)整。此外，目前市場(chǎng)上丹參藥材商品規(guī)格等級(jí)劃分較為隨意，主要表現(xiàn)在各產(chǎn)地、藥材市場(chǎng)甚至同一藥材市場(chǎng)內(nèi)的不同商戶，其規(guī)格等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)極不統(tǒng)一。此外，市場(chǎng)上丹參藥材多切制成片或段，與《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)藥材性狀描述存在差異。因此，亟待制訂符合新時(shí)期市場(chǎng)需求的丹參藥材商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以規(guī)范丹參藥材市場(chǎng)交易，引導(dǎo)市場(chǎng)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)，形成良性循環(huán)。

在丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)方面，諸多學(xué)者已開展了基于野生與栽培、不同產(chǎn)地、不同直徑等的相關(guān)研究，但主要集中在丹參酮類和丹酚酸類幾個(gè)主要的指標(biāo)性成分的含量比較[5-25]，而對(duì)于丹參多糖的比較研究較少。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，丹參多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[26-31]，可以作為丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及代謝組學(xué)分析研究方法能更加系統(tǒng)全面地闡述內(nèi)在成分的差異，較液相色譜而言更精細(xì)靈敏，且給出的質(zhì)譜信息更加豐富，可獲取更多的結(jié)構(gòu)信息，為更加深入地闡明被測(cè)物相互之間的差異提供便利。在藥材商品規(guī)格等級(jí)研究中，可將傳統(tǒng)性狀劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提煉，針對(duì)不同的劃分因素，開展系統(tǒng)地定性與定量比較分析，兼顧不同結(jié)構(gòu)類型成分，更加科學(xué)合理地制訂規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以引導(dǎo)藥材高品質(zhì)生產(chǎn)。

基于此，本研究通過產(chǎn)地及市場(chǎng)調(diào)查，梳理當(dāng)前市場(chǎng)上丹參藥材規(guī)格等級(jí)劃分現(xiàn)狀，通過收集多批次藥材，歸納總結(jié)全國(guó)范圍內(nèi)丹參藥材規(guī)格等級(jí)的主要?jiǎng)澐忠?guī)律，提煉性狀劃分的要素，采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)方法，針對(duì)不同要素對(duì)丹參中化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)表征，并結(jié)合主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)丹參不同產(chǎn)地、不同加工方法(熏硫、發(fā)汗、曬干)、不同等級(jí)樣品的化學(xué)成分進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)主要化學(xué)成分(如丹參酮類、丹酚酸類、丹參多糖類)進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)丹參藥材的化學(xué)質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)全面地評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上將內(nèi)在質(zhì)量規(guī)律與性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以期闡明丹參藥材規(guī)格等級(jí)劃分的內(nèi)在規(guī)律，制訂出科學(xué)合理的丹參藥材商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器及試劑

1.1 儀器

ACQUITY I-Class 超高效液相色譜儀、Waters Xevo-G2-S Q-TOF MS 質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Waters ACQUITY UPLC-T3-C18S色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；BSA224S型萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Centrifuge 5415D型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；SB-800-DTD型超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Pacific T-Ⅱ型超純水儀(美國(guó)Thermo公司)；WFJ型可見分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)。

1.2 試劑

蒽酮(分析純，純度>98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160315)；硫酸(分析純，純度：95%～98%，北京化工廠，批號(hào)：20160516)；對(duì)照品迷迭香酸、丹酚酸A、紫草酸、丹酚酸B、丹參素鈉、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、熊果酸、蘆丁、齊墩果酸、丹參新醌C、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、二氫異丹參酮Ⅰ、亞甲基丹參醌、丹參新醌B、四氫丹參酮Ⅰ、丹參新酮、去氫丹參新酮、異丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡA、鼠尾草酮、異隱丹參酮、隱丹參酮、3α-羥基丹參酮ⅡA、丹參二醇A、丹參二醇B、丹參二醇C、1，2-二氫丹參醌、丹參醇B、柳杉酚、鐵銹醇、二氫異丹參酮Ⅱ、1，2-二去氫隱丹參酮、丹參酮甲酯和紫丹參素C(純度≥98%，北京融誠(chéng)鑫徳科技發(fā)展有限公司)；D-葡萄糖(純度：99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201506)；甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher Scientific公司)；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 內(nèi)容

2.1 商品調(diào)查

2016年3月—2017年12月，課題組成員先后實(shí)地走訪了山東平邑、四川中江、山西運(yùn)城、河北安國(guó)、安徽亳州、河南禹州等丹參主產(chǎn)區(qū)，實(shí)地查看丹參田間管理和采收情況，對(duì)多戶藥材收購(gòu)商進(jìn)行走訪，調(diào)查丹參的初加工和規(guī)格等級(jí)劃分情況。此外，課題組還先后赴安徽亳州、河北安國(guó)、四川荷花池及廣西玉林等各大藥材市場(chǎng)，對(duì)丹參藥材進(jìn)行市場(chǎng)流通情況調(diào)查。

2.2 外觀性狀數(shù)據(jù)測(cè)量

對(duì)產(chǎn)區(qū)或藥材市場(chǎng)隨機(jī)進(jìn)行多點(diǎn)取樣，收集不同農(nóng)戶或商戶各規(guī)格等級(jí)丹參藥材，并對(duì)其進(jìn)行性狀數(shù)據(jù)測(cè)量，每份樣品隨機(jī)取10個(gè)個(gè)體并用游標(biāo)卡尺測(cè)量丹參藥材上、中、下部直徑，用直尺測(cè)量丹參藥材的長(zhǎng)度，用天平測(cè)量每個(gè)個(gè)體的質(zhì)量。丹參性狀測(cè)量原始數(shù)據(jù)參見本課題組相關(guān)研究[32]。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS分析

該部分內(nèi)容參見本課題組相關(guān)研究[32]。本研究所用的含量測(cè)定方法為基于UPLC-Q-TOF-MS的成分峰面積的半定量方法。

2.4 多糖含量測(cè)定

該部分內(nèi)容參見本課題組相關(guān)研究[32]。

3 結(jié)果

3.1 商品調(diào)查

3.1.1產(chǎn)地調(diào)查 2016年3月24日—2017年12月13日，課題組成員先后前往安徽亳州、河北安國(guó)、河南禹州、山西萬(wàn)榮、山東平邑、四川中江、陜西商洛等產(chǎn)地的藥材種植基地、醫(yī)藥企業(yè)、農(nóng)業(yè)合作社、藥材收購(gòu)站調(diào)查丹參的栽培、采收、加工、規(guī)格等級(jí)與銷售等情況。各地原藥材以統(tǒng)貨為主，四川分級(jí)較為細(xì)致，多供出口。具體情況見表1。

3.1.2市場(chǎng)調(diào)查 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各藥材市場(chǎng)以產(chǎn)地劃分規(guī)格，普遍認(rèn)為山東所產(chǎn)丹參因色紅、丹參酮類成分含量高、品質(zhì)較好，單獨(dú)作為1個(gè)規(guī)格；四川丹參主要在西南地區(qū)流通，并多供出口，分級(jí)較細(xì)；其余產(chǎn)地僅靠性狀難以準(zhǔn)確界定，大多作為統(tǒng)貨出售，市場(chǎng)大多以片或段形式，經(jīng)過篩選后分級(jí)出售。此外，尚有經(jīng)過硫熏處理的丹參，顏色較鮮艷，有硫酸味；還有斷面顏色暗黑的商品，一般稱之“發(fā)汗丹參”，但經(jīng)產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前各產(chǎn)區(qū)較少發(fā)汗，可能與市場(chǎng)流通中潤(rùn)透的處理方法有關(guān)。

3.1.3丹參藥材性狀數(shù)據(jù)測(cè)定及數(shù)據(jù)分析 因四川中江丹參、山東丹參與其他產(chǎn)地丹參外觀性狀差異較大，四川中江丹參自清代以來(lái)被稱為道地藥材，山東丹參質(zhì)量較好，且栽培、種植、加工較規(guī)范，故將四川中江丹參與山東丹參分別單獨(dú)劃分為1個(gè)規(guī)格。其他產(chǎn)地的丹參只有統(tǒng)貨與選貨之分，故將其他產(chǎn)地的丹參作為1個(gè)規(guī)格。各地丹參藥材規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制訂以產(chǎn)地采集的丹參樣品為準(zhǔn)。對(duì)各個(gè)產(chǎn)區(qū)分別進(jìn)行隨機(jī)多點(diǎn)取樣，收集不同農(nóng)戶各規(guī)格等級(jí)丹參藥材，并采用2.2項(xiàng)下方法對(duì)其進(jìn)行性狀數(shù)據(jù)測(cè)量。因每家每戶對(duì)丹參藥材的規(guī)格等級(jí)劃分稍有差異，因此先用Excel表格對(duì)各測(cè)量結(jié)果的最大值、最小值及均值進(jìn)行粗略統(tǒng)計(jì)，將樣品差異不大的歸為一類，再用SPSS 22.0軟件進(jìn)行頻數(shù)分析。

從產(chǎn)地和市場(chǎng)上采集51批不同等級(jí)的四川中江丹參，21批不同等級(jí)的山東丹參，62批不同等級(jí)的其他產(chǎn)區(qū)丹參，對(duì)丹參進(jìn)行性狀數(shù)據(jù)測(cè)定，分別計(jì)算出平均值，以中部直徑作為依據(jù)，對(duì)不同等級(jí)的樣品重新排序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一等級(jí)的直徑分布范圍較廣，不同等級(jí)丹參藥材的直徑存在交叉，說明產(chǎn)地及市場(chǎng)上四川中江丹參、山東丹參、其他產(chǎn)區(qū)丹參的商品規(guī)格等級(jí)劃分較為混亂。綜合考慮長(zhǎng)度、上部直徑、中部直徑、下部直徑、個(gè)體質(zhì)量對(duì)丹參藥材質(zhì)量的影響，設(shè)定五者的權(quán)重大小為中部直徑>長(zhǎng)度>上部直徑>下部直徑>質(zhì)量。因此以中部直徑作為主要依據(jù)，將差異不大的歸為一類，再對(duì)每一類進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)，設(shè)置置信區(qū)間百分比為99%，計(jì)算不同等級(jí)丹參的長(zhǎng)度、上部直徑、中部直徑、下部直徑的上限和下限。由置信區(qū)間計(jì)算出的四川中江丹參、山東丹參、其他產(chǎn)區(qū)丹參各等級(jí)性狀數(shù)據(jù)分布范圍見表2～4。

表1 丹參藥材產(chǎn)地調(diào)查情況

表2 由置信區(qū)間計(jì)算出的四川中江丹參各等級(jí)性狀數(shù)據(jù)分布范圍

表3 由置信區(qū)間計(jì)算出的山東丹參各等級(jí)性狀數(shù)據(jù)分布范圍

表4 由置信區(qū)間計(jì)算出的其他產(chǎn)區(qū)丹參各等級(jí)性狀數(shù)據(jù)分布范圍

3.1.4小結(jié) 根據(jù)產(chǎn)地及市場(chǎng)調(diào)查，丹參藥材當(dāng)前劃分商品規(guī)格等級(jí)的主要方法為：根據(jù)產(chǎn)地不同劃分規(guī)格，主流為四川、山東和其他產(chǎn)區(qū)3類，四川丹參劃分較細(xì)，以藥材長(zhǎng)度與直徑，劃分成多個(gè)等級(jí)，其余產(chǎn)區(qū)或做簡(jiǎn)單的分級(jí)，或作統(tǒng)貨。

基于文獻(xiàn)、產(chǎn)地及市場(chǎng)調(diào)查的結(jié)果，市場(chǎng)流通過程中丹參規(guī)格等級(jí)劃分情況見表5。

表5 市場(chǎng)流通過程中丹參規(guī)格等級(jí)劃分情況

3.2 不同產(chǎn)地丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)

丹參年需求量大，產(chǎn)地較多，但由于其為廣布種，各地性狀差異較小，且受到栽培方式的影響，因此難以僅靠性狀進(jìn)行準(zhǔn)確的產(chǎn)地界定。受生境及加工的因素影響，山東丹參皮色較紅，四川丹參較粗壯，山東及四川丹參單獨(dú)劃分規(guī)格，其余各產(chǎn)地丹參通過外觀性狀難以分清。對(duì)于不同產(chǎn)地丹參之間的成分差異已有大量研究，然而多集中于丹參酮與丹酚酸兩類代表性指標(biāo)成分含量，且不同學(xué)者得出的結(jié)論各不相同，甚至相互矛盾。基于此，本次研究選取代表性產(chǎn)區(qū)進(jìn)行取樣并對(duì)其內(nèi)在成分開展了系統(tǒng)的定性與定量比較分析，為產(chǎn)地規(guī)格的制訂提供依據(jù)。

3.2.1實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源 安徽亳州、四川中江、山東平邑、河北安國(guó)、河南禹州、山西萬(wàn)榮等產(chǎn)地信息明確的丹參。樣品信息參見本課題組相關(guān)研究[32]。粉碎，粉末過3號(hào)篩，備用。

3.2.2不同產(chǎn)地丹參次生代謝產(chǎn)物差異分析 丹參中主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜進(jìn)行推測(cè)，在總結(jié)對(duì)照品裂解規(guī)律的基礎(chǔ)上，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片結(jié)合裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)。對(duì)供試品進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Masslynx 4.1軟件中自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)以及Chemspider(http：//www.chemspider.com/)及Scifinder(https：//scifinder.cas.org/)得到可能的分子式及候選化合物。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜碎片及標(biāo)準(zhǔn)品裂解規(guī)律，結(jié)合DAD特征光譜與化合物ClogP值等信息，以及鼠尾草屬已報(bào)道的相關(guān)研究進(jìn)行成分鑒定。由于丹參酮類化合物在正離子模式下響應(yīng)較好，而丹酚酸類成分在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，因此分別采取2種掃描模式對(duì)不同組進(jìn)行比較。

3.2.3不同產(chǎn)地丹參樣品差異成分分析 對(duì)不同產(chǎn)地丹參樣品進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，將所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到QI中，采用PCA將不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行聚類，圖1是正離子模式下不同產(chǎn)地丹參的PCA聚類圖，圖2是負(fù)離子模式下不同產(chǎn)地丹參的PCA聚類圖。從聚類結(jié)果來(lái)看，不同產(chǎn)地的樣品呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，四川的丹參樣品單獨(dú)聚在一起，安徽、河南、河北的丹參相近，陜西、山西、山東的丹參相近。近代來(lái)四川被認(rèn)為丹參的道地產(chǎn)區(qū)，且規(guī)格等級(jí)劃分較細(xì)。因此，以四川丹參作為研究對(duì)象，與其他產(chǎn)地丹參進(jìn)行差異成分分析。不同產(chǎn)地丹參差異成分的鑒定分析表參見本課題組相關(guān)研究[32]。

圖1 正離子模式下不同產(chǎn)地PCA聚類圖

圖2 負(fù)離子模式下不同產(chǎn)地PCA聚類圖

將陜西、山西、山東作為1類，將其與四川進(jìn)行比較(見圖3～4，其中A為選取2組作為比較對(duì)象，B為S-plot圖，C為所選取的2組差異成分及其含量圖)，并對(duì)兩組差異貢獻(xiàn)較大的Marker進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，選取對(duì)差異貢獻(xiàn)較大的點(diǎn)，從其柱狀圖(圖3C、4C)上可以看出，差異主要體現(xiàn)在含量變化，而未見有新化合物的區(qū)別。

注：A.OPLS-DA圖；B.S-Plot圖；C.柱狀圖。下同。圖3 正離子模式下四川與陜西、山西、山東的 丹參差異成分

圖4 負(fù)離子模式下四川與陜西、山西、山東的 丹參差異成分

同樣，將安徽、河南、河北作為一類，將其與四川進(jìn)行比較(見圖5～6，其中A為選取2組作為比較對(duì)象，B為S-plot圖，C為所選取的2組差異成分及其含量圖)，并對(duì)兩組差異貢獻(xiàn)較大的Marker進(jìn)行分析，從其柱狀圖(圖5C、6C)上可以看出，差異也僅主要體現(xiàn)在含量的不同程度變化，而未見有新化合物的區(qū)別。

3.2.4不同產(chǎn)地丹參化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果 對(duì)不同產(chǎn)地丹參樣品的7個(gè)主要指標(biāo)性成分的含量進(jìn)行分析，7種化學(xué)成分平均含量百分比堆積柱形圖見圖7，結(jié)果表明陜西丹參各成分平均含量較高，二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的平均含量在山東所產(chǎn)者較高，河北、河南、安徽、四川丹參的平均含量較低；山東、安徽丹參的丹酚酸B平均含量較低。目前市場(chǎng)上普遍認(rèn)為山東丹參的丹參酮類成分含量較高，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。陜西丹參各成分含量均較高，值得進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。河北、河南、安徽丹參各成分平均含量較低，與市場(chǎng)上認(rèn)為這幾個(gè)產(chǎn)地的丹參質(zhì)量相對(duì)較差的觀點(diǎn)一致。不同產(chǎn)地丹參樣品含量測(cè)定結(jié)果參見本課題組相關(guān)研究[32]。

圖5 正離子模式下四川與安徽、河南、河北的 丹參差異成分

圖6 負(fù)離子模式下四川與安徽、河南、河北的 丹參差異成分

圖7 不同產(chǎn)地丹參7種化學(xué)成分平均含量 百分比堆積柱形圖

3.2.5不同產(chǎn)地丹參多糖含量測(cè)定結(jié)果 對(duì)不同產(chǎn)地的丹參進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，從表6結(jié)果中可以看出，不同產(chǎn)地丹參多糖平均含量存在較大差異，其中安徽丹參的多糖平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為2.44%。山西、四川丹參的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為3.53%和3.40%。

表6 不同產(chǎn)地丹參多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

3.2.6小結(jié) 由于丹參使用量大，產(chǎn)區(qū)多，不同產(chǎn)區(qū)的生境差異接近，且丹參為廣布種，生境適應(yīng)性強(qiáng)，因此不同產(chǎn)區(qū)丹參的成分差異并不大。通過液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合聚類分析，四川所處的經(jīng)緯度及生態(tài)環(huán)境較其他產(chǎn)區(qū)差異大，因此單獨(dú)成一類，這還與四川以根段繁殖的方法有關(guān)，所產(chǎn)丹參明顯較為粗壯。山東丹參在性狀上明顯較其他產(chǎn)區(qū)更紅，且因種子繁殖，根部相對(duì)較細(xì)。由于丹參酮類成分大多分布在皮層[33]，因此山東產(chǎn)丹參中該類化合物含量最高，這也和市場(chǎng)的認(rèn)知基本一致，可見 “外觀性狀(紅色)-丹參酮含量”之間具有一定關(guān)聯(lián)，這與丹參酮類化合物具有二萜萘醌類結(jié)構(gòu)[34]、共軛鏈較長(zhǎng)、可見光下呈現(xiàn)紅色對(duì)應(yīng)，也證明了性狀鑒別以色紅為佳的科學(xué)內(nèi)涵。丹酚酸類、多糖類成分主要分布在木質(zhì)部，栽培品纖維性較弱，多糖等積累較多。從丹酚酸及多糖的含量來(lái)看，四川產(chǎn)丹參較高，與其他課題組研究結(jié)果基本一致[20]。其他產(chǎn)區(qū)之間成分各有差異，但從性狀上較難準(zhǔn)確區(qū)分。鑒于此，本次將四川和山東所產(chǎn)丹參分為2個(gè)產(chǎn)地規(guī)格，其他產(chǎn)區(qū)歸并為1個(gè)規(guī)格。

3.3 不同等級(jí)丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)

丹參藥材各地區(qū)皆以直徑與長(zhǎng)度作為等級(jí)劃分指標(biāo)，一方面是為了后續(xù)飲片加工的方便，條直均勻的藥材在飲片潤(rùn)、切、干燥方面均較便利。不同粗細(xì)大小的藥材潤(rùn)透需要的時(shí)間不同，為了減少損耗，需要分檔處理，經(jīng)切制的飲片片型較規(guī)整，耗損低、品相好，因此長(zhǎng)條型根莖類藥材大多以此進(jìn)行劃分。但是受次生代謝產(chǎn)物在根部不同位置影響，近年來(lái)指標(biāo)性成分含量的引入及檢測(cè)力度的加強(qiáng)，導(dǎo)致傳統(tǒng)的劃分標(biāo)準(zhǔn)在部分藥材進(jìn)行等級(jí)劃分時(shí)出現(xiàn)倒掛的情況[35]，究其原因是不少次生代謝產(chǎn)物是植物自身防御化學(xué)物質(zhì)，大多分布在皮層，因此越細(xì)的藥材皮層所占比例越多，次生代謝產(chǎn)物含量也高。這與傳統(tǒng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中條直粗壯為佳相互矛盾。丹參在此方面尤具有代表性，如：丹參酮類成分分布在皮層，藥材越細(xì)，含量越高，如果商品規(guī)格的劃分以丹參酮作為指標(biāo)，就需要以細(xì)為佳。需要注意的是，丹酚酸及多糖類成分確與藥材粗細(xì)成正比或相關(guān)性不明顯，如以此2類成分來(lái)定，則與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)相接近。越來(lái)越多的研究表明，丹酚酸在抗炎抗凝方面藥理活性明顯，丹參多糖也具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，在丹參中所占的比重較高，丹酚酸及多糖類成分不可忽略。因此，盡管本研究對(duì)各類化學(xué)成分相關(guān)的變化趨勢(shì)做出科學(xué)分析，標(biāo)準(zhǔn)劃分時(shí)依然采取傳統(tǒng)的方法。由于丹參僅在四川做細(xì)致的等級(jí)劃分，主流分成4級(jí)，且將不符合《中國(guó)藥典》的蘆頭、節(jié)子(根的尾部)也做了區(qū)分，本研究也對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)成分比較分析。此外，山東丹參傳統(tǒng)多做統(tǒng)貨，近年來(lái)隨著價(jià)格的提升，也在產(chǎn)區(qū)做了較為簡(jiǎn)單的等級(jí)劃分。其他產(chǎn)區(qū)則多做統(tǒng)貨。本研究選取四川和山東兩地所產(chǎn)丹參作為代表，對(duì)不同等級(jí)中丹參酮、丹酚酸、多糖類成分進(jìn)行分析，得到性狀與其內(nèi)在成分規(guī)律，為科學(xué)劃分丹參商品等級(jí)提供依據(jù)。

3.3.1材料 丹參樣品從亳州、平邑、中江等丹參產(chǎn)地及河北安國(guó)藥材市場(chǎng)、亳州藥材市場(chǎng)、成都荷花池藥材市場(chǎng)、廣西玉林藥材市場(chǎng)采得，樣品信息參見本課題組相關(guān)研究[32]。

3.3.2不同等級(jí)丹參多糖的含量測(cè)定 取不同等級(jí)的丹參藥材，分別按2.4項(xiàng)下方法，制備樣品溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算多糖在樣品中的百分含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果見表7，從結(jié)果中可知，多糖在不同等級(jí)中差異較小，與粗細(xì)之間關(guān)聯(lián)性不大。

對(duì)不同等級(jí)四川中江丹參的多糖含量進(jìn)行單因素方差分析，采用Bonferroni法進(jìn)行校正的α水平為0.05。結(jié)果顯示特級(jí)與三級(jí)四川中江丹參的多糖含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，未發(fā)現(xiàn)其他等級(jí)四川中江丹參的多糖含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)不同等級(jí)山東丹參的多糖含量進(jìn)行單因素方差分析，采用Bonferroni法進(jìn)行校正的α水平為0.05。結(jié)果顯示不同等級(jí)山東丹參的多糖含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表7 不同產(chǎn)地、不同等級(jí)丹參的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3) %

3.3.3不同等級(jí)丹參樣品化學(xué)成分含量測(cè)定 將不同等級(jí)丹參樣品按供試品溶液的制備方法制備，分別注入U(xiǎn)PLC-Q-TOF-MS，將所得的峰面積分別帶入回歸方程，計(jì)算不同等級(jí)丹參樣品中咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量。不同等級(jí)丹參樣品含量測(cè)定結(jié)果參見本課題組相關(guān)研究[32]。

3.3.3.1不同等級(jí)四川丹參化學(xué)成分含量分析 對(duì)不同等級(jí)四川丹參7種化學(xué)成分的平均含量進(jìn)行比較(見表8)，可以看出特級(jí)的丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.671 0 mg·g-1，迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.273 1 mg·g-1，紫草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.623 0 mg·g-1，在4種等級(jí)中為最高；三級(jí)的丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.563 7 mg·g-1，隱丹參酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.284 0 mg·g-1，二氫丹參酮Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.108 2 mg·g-1，在4種等級(jí)中為最高。丹酚酸類成分主要分布在木質(zhì)部，丹參酮類成分主要分布在皮層，選條樣品較粗壯，皮層所占比例較小，統(tǒng)貨樣品較細(xì)，皮層所占比例較大，因此丹酚酸類成分的含量與樣品的等級(jí)是成正比，而丹參酮?jiǎng)t相反[36]。從表8可以看出，丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸總體呈現(xiàn)出丹參藥材等級(jí)越高，其平均含量越高的趨勢(shì)；丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ總體呈現(xiàn)出丹參藥材等級(jí)越高，其平均含量越低的趨勢(shì)。研究結(jié)果表明以丹參藥材的直徑大小劃分等級(jí)與成分含量之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但因成分結(jié)構(gòu)不同，分布不同而規(guī)律不同，因此僅以1類成分來(lái)談成分與直徑的相關(guān)性問題是片面的。

3.3.3.2不同等級(jí)山東丹參化學(xué)成分含量分析 對(duì)不同等級(jí)山東丹參7種化學(xué)成分的平均含量進(jìn)行比較(見表9)，可以看出選條的丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.735 2 mg·g-1，迷迭香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.266 3 mg·g-1，紫草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.806 0 mg·g-1，在3種等級(jí)中為最高；統(tǒng)貨的丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.624 2 mg·g-1，隱丹參酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.295 3 mg·g-1，二氫丹參酮Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.761 1 mg·g-1，在3種等級(jí)中為最高，此變化趨勢(shì)與四川丹參完全一致。

3.3.4小結(jié) 目前報(bào)道的丹參中化學(xué)成分主要為3類，即丹參酮類、丹酚酸類和多糖類，其中丹參酮類為二萜萘醌類，脂溶性，因共軛鏈較長(zhǎng)而大多呈現(xiàn)紅色，主要分布于丹參皮層；丹酚酸類主要為苯丙酸類結(jié)構(gòu)的聚合物，水溶性，主要分布于木質(zhì)部；丹參多糖類為葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的聚合物，在降血糖和降脂方面也起重要的作用，主要分布在皮層以內(nèi)的部分。這3類成分在丹參中的分布部位不同，導(dǎo)致不同直徑的丹參中這3類成分的比例不同，從而呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，因此僅以其中某1種成分的變化趨勢(shì)來(lái)評(píng)價(jià)當(dāng)前劃分的合理性都比較片面。根莖類藥材在后續(xù)的飲片加工中必然需要分檔處理，因此按照大小劃分至今仍然具有價(jià)值。在使用植物生長(zhǎng)激素的情況下，盲目地以大小來(lái)評(píng)價(jià)丹參的優(yōu)劣也存在問題，因此在標(biāo)準(zhǔn)制訂中也要適當(dāng)?shù)笮∮^。

3.4 不同加工方法丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)

發(fā)汗為傳統(tǒng)中藥材產(chǎn)地加工方法，目的是便于干燥，縮短干燥時(shí)間，但同時(shí)受堆放過程中溫度變化，藥材發(fā)生酶促、氧化等系列化學(xué)反應(yīng)影響，因此部分成分出現(xiàn)變化，性狀產(chǎn)生差異。如《中國(guó)藥典》在厚樸、續(xù)斷、玄參藥材加工項(xiàng)下均有“發(fā)汗”的要求，且明確描述了顏色變化。這種顏色變化大多為成分的變化，由于部分化合物發(fā)生氧化、水解、聚合等反應(yīng)，形成共軛鏈更長(zhǎng)的化合物而呈現(xiàn)出更深的顏色。一般認(rèn)為是酶促反應(yīng)或者是非酶褐變反應(yīng)。目前對(duì)于這方面的研究依然不夠深入，大多以指標(biāo)性成分的溶出度作為評(píng)判依據(jù)，多數(shù)認(rèn)為“發(fā)汗”易于有效成分的溶出。

表8 不同等級(jí)四川丹參樣品中指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g-1

表9 不同等級(jí)山東丹參樣品中指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g-1

丹參亦有“發(fā)汗”干燥的傳統(tǒng)，“發(fā)汗”后斷面顏色加深，呈紫紅色。從本次產(chǎn)地調(diào)研結(jié)果來(lái)看，各主產(chǎn)區(qū)干燥大多采用直接曬干，已較少使用“發(fā)汗”，但市場(chǎng)調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上有部分?jǐn)嗝骖伾^深的丹參切片規(guī)格，經(jīng)了解后發(fā)現(xiàn)是因?yàn)樵跐?rùn)的過程中時(shí)間較長(zhǎng)所致，與傳統(tǒng)原藥材發(fā)汗存在區(qū)別。關(guān)于此對(duì)丹參藥材內(nèi)在質(zhì)量影響的研究較少。此外市場(chǎng)尚有不同程度含硫的丹參規(guī)格，雖然硫黃熏蒸后丹參顏色鮮艷且易保存，但不屬于《中國(guó)藥典》允許的加工方法，為此本次也針對(duì)此類規(guī)格做了質(zhì)量比對(duì)研究。本研究選取從各市場(chǎng)收集的熏硫和發(fā)汗丹參，對(duì)其進(jìn)行定性及定量分析，不同加工方法丹參樣品信息表參見本課題組相關(guān)研究[32]。未將自行采集的新鮮樣品按照熏硫及“發(fā)汗”的方法進(jìn)行處理后與未處理組進(jìn)行比較，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全反映變化過程，僅可從變化趨勢(shì)上看出相互關(guān)系。

3.4.1“發(fā)汗”處理前后丹參樣品差異成分分析 采用UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行分析，以MassLynx4.1軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用EZinfo分析軟件進(jìn)行PCA聚類分析。從PCA聚類圖可以看出熏硫、“發(fā)汗”與正常組丹參各自聚在一起，見圖8A(正離子模式)和圖9A(負(fù)離子模式)。對(duì)“發(fā)汗”的丹參與正常丹參成分做了比較分析(見圖8～9，其中B為選取2組作為比較對(duì)象，C為S-plot圖，D為所選取的2組差異成分及其含量圖)，從對(duì)差異貢獻(xiàn)較大的化合物對(duì)應(yīng)的柱狀圖(圖8D、9D)中可以看出，“發(fā)汗”對(duì)于兩類化合物的影響較小，僅僅在各自的量上出現(xiàn)較小的變化。這可能與“發(fā)汗”過程中細(xì)胞破壞而改變其溶出度有關(guān)。未見含量較高的新化合物生成。

注：A.PCA聚類圖；B.OPLS-DA圖；C.S-Plot圖；D.柱狀圖。下同。圖8 正離子模式下發(fā)汗與正常丹參的差異成分

圖9 負(fù)離子模式下發(fā)汗與正常丹參的差異成分

3.4.2熏硫處理前后丹參樣品差異成分分析 采用UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行分析，以MassLynx4.1軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用EZinfo分析軟件進(jìn)行PCA聚類分析。

利用無(wú)監(jiān)督統(tǒng)計(jì)模型，結(jié)合正交偏最小二乘法進(jìn)行二維數(shù)據(jù)分析(OPLS-DA)，對(duì)熏硫與正常丹參成分進(jìn)行了比較分析(見圖10～11，其中A為選取2組作為比較對(duì)象，B為S-plot圖，C為所選取的2組差異成分及其含量圖)，選取對(duì)差異貢獻(xiàn)較大的十幾個(gè)點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，差異成分的信息見圖10C(正離子模式)和圖11C(負(fù)離子模式)，差異成分鑒定結(jié)果參見本課題組相關(guān)研究[32]。丹參酮類成分在正離子模式下響應(yīng)較好，而丹酚酸類成分在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，從圖10C的柱狀圖中可以看出，丹參酮類成分受熏硫影響較小，大多數(shù)成分未發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)與含量變化；從11C的柱狀圖中可以看出，熏硫丹參與正常丹參的差異性成分較多，主要是酚酸類等富含羥基的化合物與硫結(jié)合，形成的含硫化合物，這類化合物的結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步鑒定。

注：A.OPLS-DA圖；B.S-Plot圖；C.柱狀圖。下同。圖10 正離子模式下熏硫與正常丹參的差異成分

圖11 負(fù)離子模式下熏硫與正常丹參的差異成分

4 總結(jié)

本研究主要從商品規(guī)格等級(jí)與質(zhì)量評(píng)價(jià)兩大方面對(duì)我國(guó)各地栽培丹參與市場(chǎng)銷售丹參進(jìn)行研究，主要包括丹參的產(chǎn)地與市場(chǎng)調(diào)查、不同加工方法丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)、不同產(chǎn)地丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)、不同等級(jí)丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)等幾方面。通過對(duì)丹參藥材商品規(guī)格等級(jí)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，目前各產(chǎn)地與市場(chǎng)上丹參藥材的規(guī)格主要分為選貨、統(tǒng)貨，等級(jí)主要分為特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)，其中四川與山東丹參的等級(jí)劃分較細(xì)；不同產(chǎn)地與不同市場(chǎng)對(duì)于丹參的規(guī)格等級(jí)劃分各有不同，規(guī)格等級(jí)劃分較為混亂。根據(jù)調(diào)研結(jié)果，以丹參藥材中部直徑作為主要指標(biāo)來(lái)劃分等級(jí)，修訂標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地丹參藥材的脂溶性和水溶性成分進(jìn)行定性與定量分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的丹參藥材具有差異性。各地栽培方法不同，可能是造成不同產(chǎn)地丹參成分差異的原因之一。四川丹參采取根段繁殖，主根較為粗壯，支根少，丹參的水溶性成分主要富集于丹參根的木質(zhì)部，因此四川丹參的水溶性成分含量較高；山東丹參采取種子繁殖，第二年移栽，支根多，根較細(xì)，丹參的脂溶性成分主要富集于丹參的皮層，因此山東丹參的脂溶性成分含量較高。

對(duì)熏硫與“發(fā)汗”丹參藥材進(jìn)行定性與定量分析，發(fā)現(xiàn)不同加工方法對(duì)丹參藥材的質(zhì)量產(chǎn)生了一定的影響。熏硫丹參斷面發(fā)白，有酸味；“發(fā)汗”丹參斷面發(fā)黑。熏硫可以起到防止藥材霉變和蟲蛀、使藥材便于干燥、便于藥材貯藏等作用，但是二氧化硫?qū)τ谌梭w有害，因此要嚴(yán)格控制熏硫的程度并控制二氧化硫的殘留量。有研究表明，發(fā)汗可以提高丹參中丹酚酸類成分的含量，需要進(jìn)一步驗(yàn)證[37]。

以四川和山東丹參為例，對(duì)不同等級(jí)丹參藥材的脂溶性和水溶性成分進(jìn)行定性與定量分析，從含量測(cè)定結(jié)果可以看出，等級(jí)越高的丹參藥材水溶性成分含量越高，脂溶性成分含量越低，結(jié)合丹參藥材的性狀以及水溶性與脂溶性成分在丹參藥材中的分布規(guī)律，可以看出指標(biāo)性成分的含量與丹參藥材的等級(jí)之間存在一定關(guān)聯(lián)性。丹參的水溶性成分主要富集于丹參根的木質(zhì)部[36]，脂溶性成分主要富集于丹參的皮層；丹參等級(jí)越高，丹參根的直徑越粗，木質(zhì)部所占比重越大，皮層所占比重越小[38]，因此水溶性成分含量越高，脂溶性成分含量越低。

此外，本課題組對(duì)不同干燥方法丹參藥材也進(jìn)行了定性與定量分析[32]，發(fā)現(xiàn)丹參藥材經(jīng)過不同方法干燥后質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生差異。曬干丹參的水溶性與脂溶性成分的平均含量較高，曬干法是比較常用的干燥方法，目前各地大多采用曬干法來(lái)干燥丹參。曬干法操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)便易行，建議采用曬干法來(lái)干燥丹參。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，深入研究淺出標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮市場(chǎng)交易實(shí)際運(yùn)用中的可操作性，對(duì)丹參商品規(guī)格等級(jí)進(jìn)行劃分。具體劃分方法見表10。不同規(guī)格等級(jí)的丹參見圖12～14。不同規(guī)格丹參的斷面見圖15。

表10 丹參規(guī)格等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

注：1.當(dāng)前藥材市場(chǎng)丹參規(guī)格按照產(chǎn)地進(jìn)行劃分，有中江丹參、山東丹參及山西、安徽、河北、河南、陜西等不同產(chǎn)地的丹參，各地性狀稍有不同，應(yīng)注意區(qū)分；2.市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，野生丹參產(chǎn)量較低，不能形成商品主流，個(gè)別市場(chǎng)以滇丹參或甘西鼠尾草做野生丹參出售，均不為《中國(guó)藥典》收載之物種，應(yīng)當(dāng)注意鑒別；3.目前市場(chǎng)上存在大量切過的丹參片或段，這些片或段大小不一，厚薄不均，均不符合《中國(guó)藥典》對(duì)丹參藥材的規(guī)定，應(yīng)注意區(qū)別；4.除正常加工丹參外，市場(chǎng)上尚存在較多熏硫丹參。熏硫丹參氣味偏酸，斷面顏色發(fā)白，并呈半透明角質(zhì)樣，這類商品二氧化硫殘留量容易超標(biāo)，應(yīng)注意區(qū)分；5.市場(chǎng)上存在發(fā)汗丹參，與普通丹參區(qū)別在于斷面呈黑色，其他方面差別不明顯，因此制訂規(guī)格時(shí)不單獨(dú)列出。

注：A：特級(jí)；B：一級(jí)；C：二級(jí)；D：三級(jí)；E：統(tǒng)貨。圖12 川丹參商品規(guī)格等級(jí)圖

注：A.一級(jí)；B.二級(jí)；C.統(tǒng)貨。圖13 山東丹參商品規(guī)格等級(jí)圖

注：A.選貨；B.統(tǒng)貨。圖14 其他產(chǎn)區(qū)丹參(安徽丹參)商品規(guī)格等級(jí)圖

注：A.川丹參；B.山東丹參；C.其他產(chǎn)區(qū)丹參(安徽丹參)。圖15 不同規(guī)格丹參斷面圖