三結構域蛋白14在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

倪晨明 鄭楷煉 潘亞奇 倪燦榮 金鋼

1海軍軍醫大學附屬長海醫院胰腺外科，上海 200433；2海軍軍醫大學附屬長海醫院病理科，上海 200433

胰腺癌為早期癥狀隱匿、療效不佳、預后極差的高度惡性腫瘤，我國胰腺癌患者約占惡性腫瘤病例數的2.42%，且發病率呈現上升趨勢，嚴重威脅著患者的生命安全[1]，因此深入研究胰腺癌的發病機制，有助于胰腺癌早期診斷、延緩腫瘤發展和為治療提供精準化靶點。三結構域蛋白 14(tripartite motif 14，TRIM14)與腫瘤的生物學行為和臨床病理特征之間存在密切的關系，在腫瘤的血管生成和癌細胞轉移及凋亡抵抗中起到關鍵作用[2-3]。研究發現TRIM14可顯著激活NF-κB信號通路[4-5]，而NF-κB信號通路為胰腺癌發生、發展中的關鍵核心途徑[6]。目前TRIM4在胰腺癌中的表達意義尚不明確，其表達與NF-κB信號通路活化關系也不清楚。本研究通過檢測胰腺癌組織TRIM14、磷酸化p65(phosphorylation p65, P-p65)及NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、血管內皮細胞生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表達，分析TRIM14與NF-κB的關系，探討TRIM14在胰腺癌發生發展中的作用機制。

資料與方法

一、臨床資料及組織標本

收集2016年1月至2018年12月間海軍軍醫大學附屬長海醫院胰腺外科176例行手術切除且病理確診的胰腺癌患者癌組織及其對應的癌旁組織(距離病灶3 cm處的正常胰腺組織)標本。其中男性95例，女性81例，年齡42～73歲，平均63歲。參考美國國立綜合癌癥網2011年中文版胰腺癌指南中TNM分期標準，Ⅰ期41例、Ⅱ期83例、Ⅲ期52例；根據病理分級，低分化46例、中分化79例、高分化51例。納入患者術前均無放療、化療、生物治療等治療史，患者及家屬均簽署知情同意書。術后通過定期門診復診或電話隨訪獲取病例的復發時間及總生存時間，隨訪時間截至2019年5月。176例胰腺癌及對應癌旁組織經手術切除后，置于4%甲醛溶液固定并石蠟包埋備用，其中12例手術切除后迅速放入液氮凍存。

二、胰腺癌及對應癌旁組織TRIM14蛋白表達檢測

組織石蠟標本制作成4 μm切片，采用免疫組織化學染色法檢測組織TRIM14蛋白表達，按試劑盒說明書操作。兔抗人TRIM14多克隆抗體購于英國abcam公司，工作濃度1∶1 000；多聚物抗兔、鼠IgG-HRP二抗購于北京中杉金橋公司，工作濃度1∶5 000，最后DAB顯色，蘇木素復染。以已知陽性的人肝組織為陽性對照，用PBS代替一抗為陰性對照，以胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。由兩位病理科醫師分別鏡下閱片，針對TRIM14染色強度及范圍進行評分[5]。染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色范圍評分：<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分的乘積為總評分，1～3分為弱陽性，4～7分為中度陽性組，8分及以上為強陽性[7]。

三、胰腺癌組織TRIM14、P-p65蛋白表達檢測

取液氮凍存胰腺癌組織50 mg，碾磨成粉末狀，使用RIPA裂解液裂解組織，抽提總蛋白。采用BCA試劑盒定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測TRIM14、P-p65表達水平。小鼠抗人P-p65、小鼠抗人p65及小鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Cell Signal公司，工作濃度為1∶1 000，TRIM14一抗、二抗及其工作濃度同上。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。應用Bio-Rad 公司的全自動凝膠成像系統掃描蛋白條帶，以目的條帶與內參(β-actin)條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

四、胰腺癌組織Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達檢測

取液氮凍存胰腺癌組織，解凍后采用Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度儀法測定RNA純度及濃度。先將RNA逆轉錄為cDNA，按反轉錄試劑盒說明書操作。再用熒光定量PCR法檢測組織Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達，熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司。Bcl-xl正向引物為5′-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3′，反向引物為5′-TCCATCTCCGATTCGTCCCT-3′；CCND1正向引物為5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，反向引物為5′-CCCCTTCGCACACATTTGAA-3′；VEGF-C正向引物為5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，反向引物為5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′。以β-actin作為內參。所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。PCR反應條件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環，72℃延伸5 min，4℃ 5 min。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，按公式2-△△Ct計算目的基因mRNA表達量。

五、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織TRIM14蛋白表達

TRIM14蛋白主要定位于胞質中(圖1)。176例癌組織中TRIM14蛋白表達陰性23例(13.1%)，弱陽性39例(22.2%)，中度陽性73例(41.4%)，強陽性41例(23.3%)；癌旁組織分別為128例(72.7%)、26例(14.8%)、17例(9.7%)、5例(2.8%)。胰腺癌組織TRIM14蛋白表達總陽性率為86.9%，顯著高于癌旁組織的27.3%，差異有統計學意義(χ2=127.846，P=0.000)。

二、胰腺癌組織TRIM14表達水平與腫瘤臨床病理參數的關系

將TRIM14陰性和弱陽性表達患者歸為低表達組，中度陽性和強陽性表達患者歸為高表達組。結果顯示，胰腺癌組織TRIM14表達水平與患者的臨床分期、淋巴結轉移及浸潤深度均呈顯著相關，而與患者性別、年齡、腫瘤分化程度及遠處轉移無明顯相關性(表1)。

注：TRIM14為三結構域蛋白14圖1 胰腺癌(1A)及癌旁組織(1B)TRIM14蛋白表達(免疫組織化學染色 × 200)

表1胰腺癌組織TRIM14表達水平與腫瘤臨床病理參數的關系(例)

臨床病理參數TRIM14蛋白表達低表達組(62例)高表達組(114例)χ2值P值性別 男35600.2360.372 女2754年齡(歲) ≤6529362.1240.998 >653366分化程度 高17340.1420.931 中2851 低1729臨床分期 Ⅰ期291235.7040.000 Ⅱ期2756 Ⅲ期646浸潤深度 T1201865.7600.000 T21720 T31532 T41044遠處轉移 無53940.2680.386 有920淋巴結轉移 無30364.8410.021 有3278

注：TRIM14為三結構域蛋白14

三、胰腺癌組織TRIM14表達水平與患者預后間的關系

單因素分析結果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及TRIM14表達水平，影響總生存期的因素包括腫瘤分化程度、臨床分期、遠處轉移及TRIM14表達水平(P值均<0.05，表2)。多因素分析結果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤分化程度和TRIM14表達水平，影響總生存期的因素包括腫瘤遠處轉移及TRIM14表達水平(表2)。由此可見，TRIM14蛋白高表達是胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期的獨立危險因素。

四、TRIM14表達水平與NF-κB信號通路活化的關系

12例胰腺癌組織TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達水平見表3。胰腺癌組織TRIM14與P-p65表達的變化趨勢較為一致(r=0.86，P<0.01，圖2A)，即高表達TRIM14的胰腺癌組織的p65磷酸化程度也較高，提示NF-κB激活。胰腺癌組織NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達水平也與TRIM14表達有較高的一致性(r值分別為0.85、0.91、0.92，P值均<0.01，圖2B)，進一步表明TRIM14高表達與癌細胞NF-κB激活有明顯關系。

討 論

近年來研究報道指出，TRIM家族在腫瘤的發生發展過程中起著重要作用。TRIM14基因為其家族成員之一，定位在人的9q22號染色體上，蛋白結構包括1個卷曲螺旋域、1個B-box結構域和1個C端PRYSPRY結構域。Zhuang等[8]研究指出TRIM14過表達可加速細胞周期，通過PI3K/AKT信號通路影響細胞的有絲分裂過程。杜天明等[9]研究發現TRIM14在胃癌組織高表達，可能參與胃癌惡化的過程。白明輝等[10]發現TRIM14在胰腺癌組織中也高表達，且與胰腺癌的發生、發展及癌細胞侵襲能力之間有著密切關系，TRIM14表達水平越高，患者的預后越差。本研究結果顯示，TRIM14在胰腺癌組織高表達，與上述報道基本相符。進一步分析TRIM14表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關系，結果顯示，TRIM14表達水平與腫瘤臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移等惡性病理特征顯著相關，提示 TRIM14可能參與了胰腺癌細胞遷移和侵襲能力的調控。Cox回歸分析結果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤的分化程度和TRIM14的表達水平，影響總生存期的因素包括腫瘤遠處轉移及TRIM14的表達水平，可見TRIM14高表達是胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期的獨立危險因素。

表2 與胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期相關風險因素的分析

注：TRIM14為三結構域蛋白14

表3 12例胰腺癌組織TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA的表達水平

注：TRIM14為三結構域蛋白14；P-p65為磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1為細胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C為血管內皮生長因子-C

注：TRIM14為三結構域蛋白14；P-p65為磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1為細胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C為血管內皮生長因子-C

圖212例胰腺癌組織TRIM14表達水平與P-p65/p65比值(2A)及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達水平(2B)的相關性

TRIM14在腫瘤發生中的作用機制報道較少， Su等[4]研究發現，過表達TRIM14可通過激活NF-κB信號通路增強細胞的侵襲性。本研究發現，TRIM14表達水平與NF-κB信號通路激活狀態呈正相關，提示TRIM14可能通過活化NF-κB信號通路促進癌癥發生。進一步的調控機制尚需在體外細胞實驗中得到驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突