基于液滴界面不穩定性的表面粗糙聚合物微球的制備及其細胞捕獲應用*

王月桐 商珞然 趙遠錦?

1)(東南大學生物科學與醫學工程學院,生物電子學國家重點實驗室,南京 210096)

2)(復旦大學生物醫學研究院,復旦大學附屬中山醫院徐匯醫院,上海 200032)

具有不同組成和形態的聚合物顆粒近來受到越來越多的關注,它們的表面粗糙度顯著影響著其理化性能,尤其在調節生物材料與生物系統間的相互作用中發揮著重要作用.本文設計了一種具有表面可調褶皺結構的聚苯乙烯微球.首先通過微流控裝置產生尺寸均一的含有疏水聚合物和助表面活性劑的液滴.在有機溶劑的揮發過程中,不斷收縮的液滴出現界面不穩定現象.表面面積自發增大,固化后得到表面具有褶皺的微球.研究結果表明,調節助表面活性劑的濃度以及溶劑揮發速率均可以有效調控微球表面粗糙程度.循環腫瘤細胞捕獲實驗表明,這種褶皺結構能明顯增強細胞黏附力,提高細胞捕獲量.以上這些特征表明這種表面褶皺微球將在生物醫學分析領域具備良好的應用前景.

1 引 言

具有不同組成和形態的聚合物顆粒近來受到越來越多的關注.基于高分子材料的理化特性利用各種加工方法可以制備出不同尺寸和結構的聚合物微粒,例如光滑微球、表面粗糙微球、多孔微球、片狀微粒、紅細胞狀微球等[1,2].它們的光學、電化學性質等可以通過結構、尺寸和組成進行調節,從而在生物材料、藥理學、化工等領域有重要應用[3?5].各向異性的表面微結構是這類聚合物顆粒最突出的特征之一.表面形貌顯著影響其理化性能,例如催化性能和效率、自組裝結構、血小板黏附特性、生物化學反應程度等[6,7].更有趣的是,表面粗糙的粒子在調節生物材料和生物體系之間的相互作用方面起著至關重要的作用.具有表面粗糙結構的微粒由于與某些具有特殊形狀和表面結構的細胞及微生物在結構上有相似之處,所以會對細胞的黏附、遷移、增長和組織愈合等進行調控從而行使特定的生物學功能[8,9].因此,調控粒子的表面微觀結構在設計功能性生物材料方面提供了新的思路.

目前,有很多方法可以制備聚合物微球,主要有聚合法(如乳液聚合、懸浮聚合、沉淀聚合)、乳液-溶劑揮發法(如相分離、界面失穩)、微加工法(如軟印刷、微流控技術)等[10?12].通過調控實驗參數,可以得到各種尺寸、形狀可調的微粒.通常,由于在顆粒和介質之間的界面自由能趨于最小化,在異相體系(例如乳液、懸浮液和分散液等)中聚合制備的聚合物顆粒具有球形形貌[13,14].對于如何突破球形界面的限制產生表面粗糙的聚合物微粒這一問題,研究人員已經做了許多嘗試.其中,通過引入表面活性劑可以對乳液液滴界面現象進行調節.表面活性劑是一類兩親性物質,在乳液界面起到降低界面張力的作用,從而維持乳液穩定存在[15,16].在溶劑揮發過程中會導致界面曲率增加、界面面積減小、表面活性劑濃度增加等一系列變化.當乳液液滴界面張力不斷降低至一定程度會導致界面面積自發增大,從而使界面發生擾動,這種現象稱之為乳液液滴界面不穩定[17,18].利用此機制制備具有復雜表面微結構的聚合物微球操作簡單、可調控性強、各向異性明顯;但由于常規的攪拌等方法制備的乳液液滴單分散性較差,因此常常導致生成的微球尺寸差異較大,且該方法僅局限于兩親性嵌段共聚物的體系,而對于疏水性聚合物(均聚物或者共聚物)鮮有報道,這限制了該方法的適用范圍.微流控方法可以較好地解決乳液的單分散性問題,微流控技術是指在微尺度(幾十至幾百微米)范圍下對微量流體(10–9— 10–18L)進行系統地整合和操控的技術[19?21].在材料制備方面,微流控技術舉足輕重.通過多樣化的材料選擇和精巧的流體通道設計,可以對所生成的材料的形貌以及結構進行精確的控制,因此其在復雜形貌及多功能材料制備方面顯示出巨大的應用前景[22,23].基于微流控技術制備的微粒具有粒徑均一、尺寸可控、結構復雜、應用廣泛等明顯優勢,但其缺點是需要與其他技術相結合才能對聚合物微粒的復雜結構進行調控.因此,利用微流控技術大量生產具有可控表面粗糙度的功能化聚合物顆粒仍然是一個較大的挑戰.

本文將微流控技術與液滴界面不穩定機制相結合,構建了尺寸均一、表面粗糙結構可調的聚苯乙烯微球.如圖1所示,首先基于毛細管微流控芯片制備出單分散的水包油乳液液滴,進而研究了疏水的均聚物聚苯乙烯(Polystyrene,PS)在表面活性劑十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和助表面活性劑n-十六烷醇(n-hexadecanol,HD)的共同作用下使乳液液滴發生的界面不穩定的過程.接著,通過調控溶劑揮發速率及助表面活性劑的濃度等實驗參數實現對微球表面粗糙度的調控.由于可操控表面微結構微球在細胞培養、捕獲等方面具有的良好應用前景,我們將制備得到的微球用于循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTC)的捕獲研究,考察其對提高捕獲效率的作用效果.

圖1 表面粗糙聚苯乙烯微球的制備示意圖(a)均勻乳液液滴的微流控生成示意圖;(b)具有表面褶皺的固體微球的形成過程示意圖,在收集皿中,液滴內氯仿的揮發觸發了界面不穩定性現象,隨之產生表面的褶皺Fig.1.Schematic illustration of the fabrication of polystyrene microspheres with rough surface:(a)Schematic representation of generating uniform emulsion droplets from microfluidic devices;(b)schematic diagram of the formation process of solidified microspheres with surface wrinkles.In the collection dish,the volatilization of chloroform from droplets triggers the interface instability phenomenon,then the surface wrinkles are generated.

2 實 驗

2.1 微流控芯片制備乳液液滴

本實驗中首先通過玻璃毛細管微流控裝置制備單乳液液滴模版,玻璃毛細管的組裝按照典型的協流式單乳液通道結構來進行.分散相(內相)溶液由10 mg/mL的聚苯乙烯/ 氯仿溶液、不同濃度的n-十六烷醇/氯仿溶液組成;連續相(外相)溶液由3 mg/mL的SDS/甘油溶液組成,選擇十二烷基硫酸鈉固體粉末,溶于30 vol.%甘油/水溶液中;收集液的組分同連續相溶液.

為產生單分散性的水包油乳液液滴,將一定量的內外相溶液抽取到不同規格的玻璃注射器中并將其分別安放在蠕動泵上,設定內外相流速,啟動蠕動泵工作.通過改變內外相流速對生成乳液液滴的尺寸和產率進行調控.

2.2 表面褶皺聚苯乙烯微球的生成與調控

將上述生成的液滴收集在不同體積的SDS/甘油溶液中,可在顯微鏡下觀察到隨著有機溶劑在水相中的擴散、蒸發,乳液液滴界面不穩定現象被觸發,液滴逐漸固化并在表層形成不同程度的褶皺.懸浮在溶液中的微粒首先在去離子水中透析7天以去除表面的甘油、SDS和殘余的氯仿,然后在乙醇中透析7天以去除HD.

微球表面褶皺程度的調控可主要從以下兩個因素的調節來實現: 1)在 0—3 mg/mL 范圍內改變分散相中HD的濃度,可得到從表面平滑到高度褶皺的聚合物微粒;2)在 0.5 —10.0 mm 范圍內改變收集液SDS/甘油溶液的高度,從而影響有機溶劑的蒸發速率,造成表面形態變化.為了使微球適應于更廣泛應用的功能,將上述具有褶皺結構的微球浸泡在四氧化三鐵納米粒子分散液中并保持3 h震蕩.由于吸附有磁性納米粒子的聚苯乙烯微球在水中的沉降速度較快,因此采用靜置法使微球沉至底部,移除上方溶液后添加超純水多次洗滌.洗滌完全后,可通過外加磁鐵實現微球的快速分離.

2.3 褶皺微球用于循環腫瘤細胞(CTC)捕獲實驗

將干燥的聚苯乙烯褶皺微球樣品放入真空等離子清洗機反應腔內,等離子體處理5 min,使其惰性的表面活化,便于后續抗體的接枝和特異性固定.由于在等離子體處理過程中需要開啟真空泵,這可能會導致一部分磁性粒子的損耗,但通過增加磁性納米粒子的初始吸附數量、合理控制等離子體處理時間等措施,能夠減弱這種損耗對整個褶皺微球磁性的影響.接著,將抗上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)特異性抗體穩定、均一地修飾在聚苯乙烯微球表面.隨后,采用外周血 MCF-7 腫瘤細胞作為靶細胞,將褶皺微球添加到MCF-7細胞懸液中.為了便于觀察和計數,細胞通過鈣黃綠素染色.

3 結果與討論

微流控通道內液滴的生成是在流場作用下流體界面發生形變導致的界面不穩定性增強的結果.無論是協流式、T形,還是流動聚焦式通道,當分散相和連續相流體相遇時,分散相流體被拉伸.最終,在自由表面失穩條件下,分散相流體斷裂而形成液滴,如圖 2(a)所示.通常來講,液滴的斷裂是黏性力和界面張力相抗衡的結果,前者使界面發生形變而后者抵抗形變.另外,液滴在斷裂時對交叉口的阻隔作用會產生一個瞬時增強的上游壓力,從而帶動下一個液滴的斷裂.此外,通道的浸潤性也會影響液滴的生成,因為當連續相流體能夠優先浸潤通道內壁時,連續相流體會在內壁上形成薄膜,從而阻止分散相流體與管壁的直接接觸,這樣就可以避免三相接觸線對整個體系的影響.因此在本工作中,通過選擇合理的通道尺寸、流速條件,以及對連續相流體通道進行疏水修飾,保證了液滴能夠穩定地生成.如圖2(b)所示,體式顯微鏡下觀察收集到的乳液液滴直徑在300 μm左右,尺寸均一,分散度比較好.通過調節內外相流速能夠對生成乳液液滴的尺寸和產率進行調控,如圖2(d)和圖2(e),內相流速越小,外相流速越大,液滴尺寸越小,相應的間隔越大,即生成液滴越稀疏,產率變低.

將液滴收集在含有外相溶液的玻璃皿中,可以明顯觀察到隨著氯仿的蒸發,乳液液滴不斷縮小,同時產生“漣漪狀”物質,最后聚苯乙烯團聚成微球的形狀,呈現黑色,通過光學顯微鏡追蹤此過程如圖3所示.在有機溶劑氯仿的揮發過程中,乳液液滴變小導致了界面曲率增加、界面面積減小、表面活性劑濃度增加等一系列物理變化.當界面張力降低到一定程度時,液滴表面面積自發增大(類似于花朵綻放的過程),即觸發了乳液液滴界面不穩定機制.另外,在氯仿揮發過程中,PS 與 HD 之間因為互不相溶而發生相分離,形成非常微小的液滴.隨著整個乳液液滴體積收縮,微小液滴逐漸融合,PS微球慢慢固化過程中小液滴占據的位置成為凹陷孔隙,進一步增加了微球表面的粗糙度.待氯仿徹底揮發后,該結構被固定,最終得到表面具有凹陷孔隙分布和均勻凸出褶皺結構的微球.由于液滴是基于微流控芯片產生的,具有均一的尺寸分布,因此同等條件下經過氯仿揮發后的固化微球也具有較為良好的單分散性,微球直徑在80 μm左右,如圖2(c)所示.

圖2 (a)微流控通道內液滴的實時生成圖像,比例尺為 600 μm;(b),(c)液滴及其相應 PS 微球的光鏡圖片,比例尺分別為 200和80 μm;(d),(e)液滴直徑和內外相流速之間的曲線關系圖:(d)當內相流速保持在 0.1 mL/h 不變時,液滴直徑與外相流速間呈負相關;(e)當外相流速保持在5 mL/h不變時,直徑與內相流速呈正相關Fig.2.(a)Real-time images of droplets generated in the microfluidic device,the scale bar is 600 μm;(b),(c)microscope photographs of the(b)droplets and(c)the resultant PS microparticles.The scale bars are 200 μm in(b)and 80 μm in(c),respectively;(d),(e)Relationships of the droplets radius with(d)the same inner flow rate and(e)the same outer flow rate,respectively.Error bars represent standard deviations.

圖3 體式顯微鏡下觀察到的具有褶皺表面的微球的生成過程.隨?著氯仿的蒸發,乳液液滴不斷縮?小,同時產生“漣漪狀”物質,最后 PS 玻璃化形成固化微球,此過程在常溫下約持續 1 min.圖(a)(f)的比例尺為 300 μm,圖(g)(i)的比例尺為 250 μmFig.3.Formation process of microspheres with wrinkled surface observed under the microscope.With the evaporation of chloroform,the droplets continue to shrink,and meanwhile,the "ripple-like" substance is produced.Finally,the PS vitrifies to form solidified microspheres.This process lasts about 1 minute at the room temperature.The scale bars are 300 μm in(a)?(f)and 250 μm in(g)?(i),respectively.

我們探究了內相溶液中HD的濃度和收集液高度這兩個主要因素對微球表面褶皺度的影響.當HD的濃度從0逐步增加到3 mg/mL時,微球表面褶皺度發生了明顯的變化.內相溶液中不含HD,即濃度為 0 mg/mL 時,所得微球表面非常平滑,幾乎沒有褶皺,其光鏡和電鏡的表征圖像如圖4(a)和圖 4(d)所示.當 HD濃度提高到 0.5 mg/mL時表面出現局部不平滑的區域(圖4(b)和圖4(e)),具體表現為微球表面形成了凹陷孔隙的分布.如圖 4(c),圖 4(f)—圖 4(h),圖 4(j),和圖 4(k)顯示,從 1 mg/mL開始微球表面出現均勻褶皺,在1—3 mg/mL 之間,隨著 HD 濃度的增加,微球表面伸出的粗糙結構長度不斷增加.當濃度達到3 mg/mL 時,球體核心變得非常小,被大幅度褶皺覆蓋.助表面活性劑HD的濃度對表面形貌的影響可歸結于HD分子在油/水交界面處的累積和重排,且進一步滲透到SDS單層中誘導SDS的組裝,兩個過程都共同導致了乳液液滴界面張力的降低,從而引起界面不穩定現象的發生,產生了伸展出表面的褶皺.

圖4 具有不同表面褶皺度的聚苯乙烯微球的光鏡和電鏡表征.這些微球是由含有相同濃度PS和不同濃度HD的液滴模板固化得到,其對應的 HD 濃度如下?:(a),(d?)0 mg/mL;(b),(e)0.5? mg/mL;?(c),(f)1 mg/mL;(g),(j)1.5 mg/mL;(h),(k)2 mg/mL;(i),(l)3 mg/mL.光鏡圖片((a)(c),(g)(i))和電鏡圖片((d)(f),(j)(l))的比例尺分別為 45和30 μmFig.4.The optical microscopy and SEM images of the PS microparticles with different surface-roughness.They are obtained from microfluidic droplet templates containing 10 mg/mL PS and varied concentrations of HD:(a),(d)c=0 mg/mL;(b),(e)c=0.5 mg/mL;(c),(f)c=1 mg/mL;(g),(j)c=1.5 mg/mL;(h),(k)c=2 mg/mL;and(i),(l)c=3 mg/mL.The scale bars are 45 μm in((a)?(c),(g)?(i))and 30 μm in((d)?(f),(j)?(l)),respectively.

另外,當收集液 SDS/甘油的液面高度在0.5—10.0 mm 范圍內變化時,保持容器底面直徑固定,隨著收集液體積增加,褶皺度逐漸降低,這與HD的濃度變化的影響相反.由此可見,水層高度明顯影響有機溶劑的揮發速率,從而可以通過調節揮發速率的快慢制備各種形態的聚合物粗糙微球.綜合來看,乳液液滴揮發觸發的界面失穩過程和液滴的相變是兩個競爭性的過程,當溶劑揮發非常快時,乳液液滴中的界面張力降低占主導作用,首先發生了界面不穩定現象,然后固化形成粗糙微球;當溶劑揮發非常慢時,液滴在沒有達到很低的界面張力時就已經固化,形成了較光滑的微球.

由于微球表面褶皺之間的間隙較小,磁性納米粒子能夠被吸附在間隙中并保持穩定.宏觀磁吸實驗可以證明,微球整體可以在磁場的作用下進行可控運動.將一批表面載有磁性納米粒子的褶皺微球裝在透明玻璃瓶內,在永磁鐵的作用下,可以觀察到微球被吸引到靠近磁鐵的瓶壁一側,如圖5所示.因此可以證明,所制備的微球具有磁控運動特性,這為后續的細胞捕獲和富集帶來了極大便利.

圖5 表面包覆有四氧化三鐵納米粒子的聚苯乙烯褶皺微球被賦予較強的磁響應性.在永磁鐵的引導下,微球被吸引到靠近磁鐵的瓶壁一側.圖中比例尺為1.5 cmFig.5.Strong mangnetic responsiveness of the highly textured PS microparticles coated with Fe3O4 nanoparticles.Under the guidance of the permanent magnet,the microspheres are attracted to the side of the bottle wall near the magnet.The scale bar is 1.5 cm.

圖6 被捕獲在微球表面的循環腫瘤細胞的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像(a)橫截面熒光圖像;(b)明場圖像;(c)(a)和(b)合并后的圖像;(d)細胞捕獲數量與微球表面褶皺度的關系Fig.6.The CLSM images of CTC captured onto the surface of the PS microparticles:(a)The cross-section fluorescent images;(b)the white-light images,and(c)the merged images.The scale bar is 30 μm;(d)the relationships of the number of captured cells with the extents of surface wrinkles.

由于粗糙表面有利于細胞黏附、傳播和生長,我們探究了這種表面褶皺微球的腫瘤循環細胞捕獲應用.長期以來,臨床在癌癥的診斷與治療中,通常是利用組織細胞活檢來進行確診并跟蹤治療效果,這種方法不僅會給患者帶來身體上的創傷,而且價格昂貴.診斷癌癥更好的方法是對游離在血液中的腫瘤細胞,即循環腫瘤細胞進行檢測.CTC被認為是癌癥轉移的一個重要因素,但是它在血液循環系統中的含量極少,一般 1 mL 血液中只有 1—10 個,因此急需高效的捕獲和富集載體[24,25].我們將表面修飾特異性抗體的褶皺微球加入到細胞懸液中并進行染色觀察,如圖6(a)—圖6(c),共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)圖像顯示鈣黃綠素染色的MCF-7細胞附著在褶皺表面,且發出明亮的綠色熒光.為了獲得更高的捕獲效率,我們還探索了細胞數量與褶皺程度之間的關系.為此,將具有相同濃度抗體,但褶皺度不同的微球與相同濃度的細胞一起孵育,根據CLSM圖像計算并分析捕獲的細胞.圖6(d)顯示在光滑聚苯乙烯微球表面捕獲的細胞數量較少,而隨著褶皺程度的增加,被捕獲的數量相應增多.

4 結 論

提出了一種具有表面粗糙微結構的聚苯乙烯微球的可控制備方法.采用微流控技術制備出單分散的乳液液滴,原位觀測乳液液滴的界面不穩定現象及微球的形成過程,并對其形成機制進行了分析,提出了界面不穩定現象發生的機理.表面活性劑SDS及助表面活性劑HD的加入使得溶劑揮發過程中界面張力降低而觸發乳液液滴界面不穩定,最終得到表面粗糙結構的聚合物微球.改變HD的濃度以及有機溶劑的揮發速率可以有效調控微球表面的粗糙程度.制備的粗糙微球還可以吸附磁性納米粒子、包覆熒光染料等,且其粗糙褶皺結構有利于增加與細胞間的黏附作用,因此我們進一步探究了微球在捕獲外周血中CTC的作用效果.我們發現,微球捕獲富集細胞的能力與其表面褶皺程度呈現正相關,因此能夠通過調控粗糙度實現CTC捕獲效率的精確控制.此外,這種用于制備具有高度褶皺表面顆粒的通用方法還可以擴展到其他類型的疏水性聚合物,其將在藥物遞送、生化分析、組織工程、催化涂覆和裝置制造領域中有重要的潛在應用.