莪術醇的結構修飾以及抑制黑色素含量研究

陳 亮，陸雪瑩，黃烈軍，蹇軍友，金 軍，顧 瑋，苑春茂，郝小江*

1貴州大學藥學院，貴陽 550025；2貴州醫科大學藥用植物功效與利用國家重點實驗室；3貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽 550014；4中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室；5中國科學院新疆理化研究所，烏魯木齊 830011

莪術為姜科植物莪術、郁金、廣西莪術的干燥根莖，目前已大量人工栽培，資源充足，莪術醇為莪術油的主要活性成分，在莪術油中含量7%～8%，對莪術油藥效的貢獻最大[1]。文獻報道莪術醇皮下注射對小鼠肉瘤S37、宮頸癌U14、艾氏腹水癌均有明顯的抑制作用[2]。為了探索對黑色素的影響，我們選用黑色素瘤(B16)細胞，進行了莪術醇對細胞內黑色素含量的測定并以莪術醇為前體，對其化學結構進行修飾，合成了系列衍生物，以期發現新的抑制黑色素含量的化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

莪術油購自江西吉安市青原區友才天然香料油有限公司；實驗所用試劑除特別說明外皆為市售分析純試劑，且未經純化直接使用；B16小鼠黑色素瘤細胞購自中國科學院細胞庫，目錄號TCM 2；核磁共振儀:INOVA-400和600型(Bruker公司，瑞士，TMS為內標)；ESI-MS質譜儀:惠普LC-MSD型高效液相色譜-質譜聯用儀。

1.2 莪術醇制備

將購得的2 kg莪術油經粗硅膠(40～80目)拌樣后，進行柱層析色譜(石油醚∶乙酸乙酯=60∶1)的分離得到含莪術醇粗品，將所得到的粗品進行重結晶(乙醇)，得到185 g白色晶體，易溶于氯仿。

1.3 莪術醇衍生物的制備

莪術醇衍生物的設計合成路線見圖1。

圖1 莪術醇衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route of curcumol derivatives注：試劑及反應條件(a)HBr，acetone，60 ℃(b)O3，Me2S，-78 ℃；(c)(BMIM)NTf2，(CH2O)n，i-Pr2NH·TFA；(d)Chloroacetic anhydride，NaH，DCM；(e)BOC-L-Leucine，NaHCO3，CSF，DMF；(f)m-CPBA，DCM；(g)NaOH，isopropyl alcohol；(h)NIS，PPh3，DCM；(i)Diethylamine，K2CO3，THF，70 ℃/NH3·H2O，40 ℃；(j)Carboxylic acid，DMAP，DCC，DCM；(k)4-Nitrobenzoyl chloride，NaH，KI，DMF。

1.3.1 2，7-二異丙基-1，4-二甲基-2，3-二氫環戊烷并環庚三烯-6(1H)-酮(1)的制備

在50 mL反應瓶中加入30 mL丙酮，再加入5 mL 40%的氫溴酸溶液，在此體系中加入無水硫酸鈉干燥三小時，再加入五氧化二磷深度除水，過濾，得濾液[3]。將100 mg莪術醇溶于此濾液中，加熱回流，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加入飽和碳酸氫鈉溶液中和體系中過量的溴化氫，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得35 mg白色固體(1)。

1.3.2 (3S，3aS，5S，6R，8aR)-3-甲基-5-異丙基-7-甲烯基-8H-3a，6-環氧莪術-6-醇-8-酮(2)的制備

在50 mL反應瓶中加入20 mL二氯甲烷(DCM)，加入100 mg莪術醇，置于低溫反應器中，將溫度設置為-78 ℃，在此溫度下攪拌15 min[4]。隨后，利用臭氧發生裝置，向反應體系中通入臭氧，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加入0.2 mL二甲硫醚，室溫攪拌3 h后，依次用飽和亞硫酸氫鈉，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得48 mg無色透明液體(Z-1)。

在25 mL反應瓶中，依次加入2 mL 1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亞胺((BMIM)NTf2)，中間體Z-1(19 mg，0.08 mmol)，多聚甲醛(5 mg，0.16 mmol)及催化劑三氟乙酸二異丙基胺鹽(i-Pr2NH·TFA)(18 mg，0.08 mmol)，70 ℃下反應[5,6]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用1 N的鹽酸水溶液,1 N的氫氧化鈉水溶液，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，刮板，得17 mg白色固體(2)。

1.3.3 2-((3S，3aS，5S，6R，8aS)-3-甲基-5-異丙基-8-甲烯基八氫-6H-3a，6-環氧莪術-6-醇)-2-氧代乙基BOC-L亮氨酸(3)的制備

在50 mL反應瓶中，加入20 mL二氯甲烷 (DCM)，加入莪術醇(300 mg，1.27 mmol)及氫化鈉(NaH)(305 mg，12.7 mmol)，室溫攪拌30 min，隨后加入氯乙酸酐(543 mg，3.2 mmol)，室溫攪拌[4]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，依次用飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=100∶1)得257 mg無色透明液體(Z-2)。

在25 mL反應瓶中，加入10 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再依次加入中間體Z-2(22 mg，0.071 mmol)，BOC-L亮氨酸(17 mg，0.071 mmol)，碳酸氫鈉(NaHCO3)(6 mg，0.071 mmol)以及催化量的氟化銫(CSF)，室溫攪拌15 min，隨后加熱至70 ℃反應，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1)得28 mg無色透明液體(3)。

1.3.4 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-5-異丙基-8-(N，N-二乙基-氨基甲基)-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環氧莪術-6-醇(4a)的制備

在100 mL反應瓶中，加入50 mL二氯甲烷(DCM)，加入莪術醇(1 g，4.24 mmol)及間氯過氧苯甲酸(1.096 g，6.36 mmol)，室溫下攪拌[4]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和亞硫酸氫鈉，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，得粗品中間體(Z-3)，將其溶于30 mL異丙醇中，加入氫氧化鈉(512 mg，12.72 mmol)，70 ℃下反應，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)得744 mg白色固體(Z-4)。

在50 mL反應瓶中，加入20 mL二氯甲烷(DCM)，依次加入中間體Z-4(300 mg，1.2 mmol)，N-碘代丁二酰亞胺(NIS)(405 mg，1.8 mmol)及三苯基膦(PPh3)(471mg，1.8mmol)，室溫下攪拌[7]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=15∶1)得264 mg淺黃色液體(Z-5)。

在25 mL反應瓶中，加入10 mL 四氫呋喃(THF)，依次加入中間體Z-5(100 mg，0.276 mmol)，二乙胺(43 μL，0.414 mmol)及碳酸鉀(K2CO3)(57 mg，0.414 mmol)，70 ℃下反應[8]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶丙酮=20∶1)得77 mg淺黃色透明液體(4a)。

1.3.5 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-5-異丙基-8-氨甲基-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環氧莪術-6-醇(4b)的制備

在25 mL反應瓶中，加入中間體Z-5(132 mg，0.365 mmol)及14 mL氨水，40 ℃下反應[8]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，減壓濃縮，經柱色譜(三氯甲烷∶甲醇=20∶1)得48 mg白色固體(4b)。

1.3.6 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-8-羥甲基-5-異丙基-8-[(2-甲基-苯甲酰氧基)甲基]-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環氧莪術-6-醇(5a)的制備

在25 mL反應瓶中，加入10 mL二氯甲烷(DCM)，再依次加入中間體Z-4(31 mg，0.4 mmol)，鄰甲基苯甲酸(20 mg，0.15 mmol)，二環己基碳二亞胺(DCC)(76 mg，0.369 mmol)及催化量4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌[9]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和碳酸氫鈉，飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得32 mg無色透明液體(5a)。

1.3.7 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-8-羥甲基-5-異丙基-8-[(3，5-二硝基-苯甲酰氧基)甲基]-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環氧莪術-6-醇(5b)的制備

在25 mL反應瓶中，加入15 mL二氯甲烷(DCM)， 再依次加入中間體Z-4(103 mg，0.41 mmol)，3,5-二硝基苯甲酸(104 mg，0.49 mmol)，二環己基碳二亞胺(DCC)(253 mg，1.23 mmol)及催化量4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌[9]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，依次用飽和碳酸氫鈉，飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得106 mg白色固體(5b)。

1.3.8 (3S，3aS，5S，6S，8aS)-3-甲基-8-羥甲基-5-異丙基-1，2，3，4，5，8a-六氫-6H-3a，6-環氧莪術-6-醇對硝基苯甲酸二酯(6)的制備

在50 mL反應瓶中，加入15 mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，依次加入中間體Z-4(158 mg，0.627 mmol)，氫化鈉(NaH)(150 mg，6.27 mmol)及催化量碘化鉀(KI)，室溫攪拌15 min，隨后加入對硝基苯甲酰氯(348 mg，1.88 mmol)，室溫下攪拌[4,9]，TLC(5%的硫酸乙醇顯色)跟蹤至反應完全，加水淬滅，依次用飽和酒石酸，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，經柱色譜(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得137 mg白色固體(6)。

1.4 莪術醇衍生物抑制黑色素含量的測定

所合成的莪術醇衍生物1、2、3、4a、4b、5a、5b、6，采用NaOH裂解法測定細胞內的黑色素含量[10]。將處于對數生長期的B16細胞消化，接種于6孔板中，濃度為2×105個/孔，并置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。待細胞完全貼壁后用藥，并繼續培養72 h。棄去上清液，PBS洗滌2次，使用細胞刮收集細胞后每孔加入細胞裂解液200 μL。于4 ℃充分裂解40 min后，12 000 rpm離心20 min。轉移上清至EP管測定蛋白濃度。沉淀物中加入190 μL 1 mol/L的NaOH(含10% DMSO)裂解液，并于80 ℃水浴1 h充分溶解后，在405 nm處測定吸光值，最終的黑色素含量使用相對蛋白濃度歸一化處理。計算公式為黑色素相對含量=(OD405樣品/蛋白濃度)/(OD405空白/蛋白濃度)×100%，每個樣品重復3次進行測定。

2 結果與討論

2.1 莪術醇的結果表征

1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：4.87(s，2H，H-9)，2.55(m，2H，H-7)，2.14(m，2H，H-4)，1.00(d，J=4.0 Hz，3H，H-12)，0.90(d，J=4 Hz，3H，H-11)，0.86(d，J=4 Hz，3H，H-13)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：144.8(C-8)，113.0(C-9)，104.7(C-6)，88.2(C-3a)，56.4(C-5)，54.6(C-8a)，39.5(C-3)，38.9(C-7)，34.8(C-4)，31.0(C-2)，28.8(C-10)，28.3(C-1)，23.2(C-11)，21.6(C-12)，12.5(C-13)；HR-ESI-MS:m/z259.1667 [M+Na]+(calcd for C15H24O2Na，259.1669)。與文獻[11-13]中莪術醇的核磁數據比較，確定所得晶體化合物為莪術醇。

2.2 莪術醇衍生物的結果表征

化合物1白色固體，收率33%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.08(s，1H，H-6)，7.00(s，1H，H-9)，3.46(hept，J=6.8 Hz，1H，H-11)，3.07(p，J=7.0 Hz，1H，H-4)，2.81 (dd，J=16.7，7.7 Hz，1H，H-2)，2.54(dd，J=16.7，11.5 Hz，1H，H-2)，2.22(s，3H，H-14)，1.92(m，1H，H-3)，1.73(m，1H，H-6)，1.17(d，J=3.1 Hz，3H，H-15)，1.16(d，J=3.1 Hz，3H，H-12 or H-13)，1.04(d，J=7.1 Hz，3H，H-12 or H-13)，0.99 (d，J=2.0 Hz，3H，H-17 or H-18)，0.98(d，J=2.2 Hz，3H，H-17 or H-18)；13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ：185.3(C-8)，158.6(C-7)，151.8(C-5)，144.9(C-1)，144.8 (C-10)，138.8(C-9)，130.7(C-6)，48.7(C-3)，46.7(C-4)，38.6(C-2)，29.7(C-11)，28.3(C-16)，25.0(C-14)，22.6(C-12)，22.4(C-13)，21.7(C-17)，21.6 (C-18)，14.2(C-15)；HR-ESI-MS:m/z281.187 3 [M+Na]+(calcd for C18H26ONa，281.187 6)。

化合物4a淺黃色透明液體，收率90%。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：5.76(s，1H，H-7)，3.10(d，J=13.1 Hz，1H，H-9)，2.77(d，J=13.5 Hz，1H，H-9)，2.61(s，2H，H-1′)，2.40(s，2H，H-1′′)，1.02(d，J=6.7 Hz，12H，H-11，H-12，H-2′ and H-2′′)，0.90(d，J=6.6 Hz，3H，H-13)；13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ：143.1(C-8)，126.0(C-7)，103.4(C-6)，87.0(C-3a)，59.5(C-9)，56.8(C-5)，50.3(C-8a)，47.0(C-1′ and C-1′′)，40.3(C-3)，36.7(C-4)，31.2(C-2)，31.0(C-10)，27.4(C-1)，22.7(C-11)，21.4(C-12)，11.8(C-13)，11.6(C-2′ and C-2′′)；HR-ESI-MS:m/z308.258 4 [M+H]+(calcd for C19H34NO2，308.258 4)。

化合物4b白色固體，收率53%。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：7.97(s，2H，N上氫)，6.15 (s，1H，H-7)，3.72(d，J=14.6 Hz，1H，H-9)，3.63(d，J=15.5 Hz，1H，H-9)，1.01(d，J=5.9 Hz，3H，H-12)，0.99(d，J=6.5 Hz，3H，H-11)，0.86(d，J=6.0 Hz，3H，H-13)；13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ：136.33(C-8)，127.54(C-7)，103.83(C-6)，87.33(C-3a)，58.62(C-5)，50.53(C-8a)，42.20(C-9)，40.17(C-3)，35.94(C-4)，31.30(C-2)，30.44(C-10)，27.52(C-1)，22.68(C-11)，21.90(C-12)，11.82(C-13)；HR-ESI-MS:m/z252.195 4 [M+H]+(calcd for C15H26NO2，252.195 8)。

2.3 細胞內黑色素含量測定

表1 細胞內黑色素含量測定

經Grphpad prism軟件分析，各組之間對比，均無顯著性差異，其中與陰性對照組相比，化合物1、2、3、4a、4b、5a、5b、6以及莪術醇的P值分別為0.94、0.78、0.63、0.60、0.74、0.40、0.19、0.13、0.23。由含量測定結果首次發現，先導化合物莪術醇具有一定美白作用，8個衍生物中有2個衍生物的抑制黑色含量的作用超過莪術醇。中間體Z-4，9位羥基上接入3，5-二硝基苯甲酸(5b)，成酯鍵后作用比莪術醇強；中間體Z-4，9位羥基和半縮酮羥基上都接入對硝基苯甲酰氯(6)成酯鍵后作用也比莪術醇強，而且也比化合物5b的作用強。而中間體Z-4，9位羥基上接入鄰甲基苯甲酸(5a)，成酯鍵后作用則明顯降低，比莪術醇弱。由此可見Z-4中間體羥基上引入苯環上具有吸電子基團的苯甲酸成酯鍵后的抑制黑色含量的作用要優于引入苯環上具有給電子基團的苯甲酸。莪術醇在酸性條件下發生開環重排得到的衍生物1，針對半縮酮羥基的修飾，得到的衍生物3，莪術醇經過臭氧化，再經過mannich反應，得到具有α，β不飽和酮結構的衍生物2，以及引入含氮基團得到的衍生物4a和4b，其作用均比莪術醇弱。

3 結論

本文首次發現莪術醇具有抑制B16細胞中黑色素的活性，具有一定的美白作用。以莪術醇為前體，制備了8個系列衍生物，其中2、3、5a、5b、6為新化合物，經抑制黑色素含量的測定，其中衍生物5b和6的抑制黑色素含量的作用要優于莪術醇。經初步的構效關系分析可知，在中間體Z-4羥基上引入苯環上具有吸電子基團的苯甲酸成酯鍵后的抑制黑色素含量的作用要優于引入苯環上具有給電子基團的苯甲酸。研究結果對于莪術醇的結構修飾及其美白作用的深入研究具有一定的參考價值。