復方精油香氣抗抑郁作用研究

王 瑩，陶鳳瑛，崔東紅，劉玉敏，吳亞妮

1上海交通大學設計學院；2上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心；3上海交通大學分析測試中心,上海 200240

精神疾病是世界公共衛生領域的一項重大難題，據估計2020年抑郁癥可能發展成為世界第二大危害人體健康的疾病[1]。作為一種情感性障礙的臨床類型精神疾病，抑郁癥具體表現為睡眠困難、興趣喪失、食欲降低、情緒不穩定等[2,3]。近幾年研究發現，抑郁癥與神經遞質的改變[4]，下丘腦-垂體-腎上腺軸[5]以及谷氨酰胺神經轉錄系統的紊亂[6]相關。西藥治療作為臨床治療抑郁癥的常用方式，存在有一定毒副作用和藥物依賴性的問題。芳香嗅吸療法因操作方便、對紓解不良情緒具有良好的作用而在生活中被廣泛使用，有望逐步成為對傳統醫療手段的有益補充。

目前關于抑郁癥的干預研究主要集中在中、西醫藥物的應用，少有關于抗抑郁復方精油香氣應用于臨床的作用分析。本文基于氣相色譜高通量飛行質譜(GC-TOF/MS)技術，分析抑郁癥患者聞香前后尿液中差異代謝物的變化，初步探討復方精油香氣抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

抗抑郁復方精油，由上海交通大學設計學院芳香療法研究室提供，批號為20150316，主要由薰衣草、苦橙花、大西洋雪松、佛手柑、依蘭依蘭、檀香木、玫瑰等復配而成。尿素酶，生工生物工程；BSFTA(硅烷化試劑)、2-氯苯丙氨酸、甲醇/氯仿(3∶1)、甲氧胺吡啶溶液均使用上海交通大學分析測試中心試劑。

1.2 基于GC-MS技術測定抗抑郁復方精油精油成分

1.2.1 GC-MS儀器條件

7890B-5977B氣相色譜質譜聯用儀；色譜柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；溫程序：初始柱溫50 ℃，加熱1 min后以3 ℃/min加熱至110 ℃，再以5 ℃/min加熱至220 ℃，保持5 min；載氣為高純度氦氣。質譜儀條件：電離方式設為E1，電離電壓：70 eV；離子源溫度200 ℃；采用全掃描方式掃瞄，掃描范圍設為10～600m/z。

1.2.2 數據處理

結合GC/MS標準質譜數據庫進行成分的定性分析，按照標準譜圖與色譜峰的質譜碎片圖對照，人工檢索確定每一種成分的化學結構；定量分析是根據檢測到的色譜峰峰面積歸一化法，計算各成分間的相對含量。

1.3 人體尿液樣本代謝物研究

1.3.1 實驗分組

志愿者尿液樣本均來自于上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心。其中抑郁癥患者44人，根據DSM-IV(美國精神障礙的診斷與統計手冊)確診，抑郁癥狀至少一個月。所有患者自愿接受實驗并簽署知情同意書，均無香氣或香料物質過敏史及心肝腎等疾病。健康組為同期醫院體檢的健康人群，體檢身體健康，無臨床癥狀表現。具體情況如表1所示，3組性別、年齡、體重差異均無統計學意義。

表1 志愿者生理指標詳表

注：P>0.05，證明差異無統計學意義。

Note:P:analysis of variance shows thatP>0.05,which proves that the difference is not statistically significant.

1.3.2 實驗設計

抑郁患者聞香組每天在下午2時集中在治療室內嗅聞香氣45 min；抑郁患者不聞香組及健康組分別在下午2時集中在治療室休息45 min。分別在第0天、第10天、第20天對3組研究對象進行尿液的采集與處理。

1.3.3 GC-TOF/MS質譜檢測程序

Agilent 6890N色譜儀；色譜柱：DB-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序：80 ℃加熱兩分鐘，以10 ℃/min加熱至180 ℃，再以5 ℃/min加熱至240 ℃，最后以25 ℃/min加熱至290 ℃，加熱9 min;載氣流速(恒流)1 mL/min；載氣：氮氣。質譜儀的電離方式設為E1，電離電壓：70 eV；進樣口溫度270 ℃；接口溫度260 ℃；離子源溫度200 ℃；采用全掃描方式掃瞄，掃描范圍設為30～600m/z，20張/s TOF質譜圖采集。

1.3.4 數據處理及分析

將獲得的原始數據導入Marker Lynx軟件包，生成含有保留時間、質荷比、峰面積的三維矩陣。將處理后生成的文件導入 SIMCA-P 14.1 軟件中進行分析，選擇VIP>1的物質作為主要潛在代謝標志物。根據所對應的保留時間和質荷比(m/z)，初步確認潛在標志物的結構并確定物質。最后通MetaboAnalyst 4.0生物學數據庫進行代謝通路的分析。

圖1 抗抑郁復方精油GC/MS總離子流圖Fig.1 TIC of compound essential oil derived by GC/MS

2 結果

2.1 復方精油成分結果分析

抗抑郁復方精油的總離子電流圖見圖1，精油的分析結果見表2，共鑒定出41種化學物質，占揮發油總含量的98.638%。其中含量最高的是右旋檸檬烯(7.35%)，其次是香茅醇(9.37%)、乙酸芳樟酯(6.92%)、芳樟醇(6.71%)等。

表2 抗抑郁復方精油主要成分和相對含量

續表2(Continued Tab.2)

序號No.化學成分Chemical composition保留時間tR(min)相對含量Relative content (%)39肉豆蔻酸異丙酯 Isopropyl myristate28.643 81.8940脫氫樅酸甲酯 Methyl dehydroabietate33.779 61.1741松香酸甲酯 Methyl abietate34.226 40.26

2.2 尿液GC-TOF/MS圖譜分析

圖2為志愿者尿液的TIC圖，從圖中可以看出在聞香前后一些譜峰出現了較為明顯的差異，圖譜包含了大量參與氨基酸代謝與牛磺酸代謝的各類代謝物的信息。

圖2 志愿者尿液GC-TOF/MS總離子流圖Fig.2 TIC of urine samples from volunteer derived by GC-TOF/MS

2.3 模式識別與判別分析

2.3.1 主成分分析得分圖

對數據進行模型擬合分析，PCA(主成分分析)如圖3-圖4所示。圖3為正常組和抑郁患者不聞香組的對比結果，由于個體差異等原因，出現了離群樣本點，模型累積解釋率R2X=0.658，Q2=0.434，因此當前 PCA模型能夠解釋兩組樣本之間的代謝差異。圖4為正常組和抑郁患者聞香組的對比結果。模型累積解釋率R2X =0.728，Q2=0.435，建立的PCA模型較為可靠。

2.3.2 OPLS-DA(正交偏最小二乘判別) 模式識別

圖5為正常組與抑郁患者不聞香組的OPLS-DA圖，說明在不聞香的情況下，抑郁患者的情況沒有得到改善。R2X= 0.590，R2Y= 0.190，Q2=0.684，建立的數學模型可靠。

圖3 正常組與抑郁患者不聞香0天、10天、20天的PCA得分圖Fig.3 PCA scores plot of normal group and depression group without aroma for 0,10 and 20 days

圖4 正常組與抑郁患者聞香0天、10天、20天的PCA得分圖Fig.4 PCA scores plot of normal group and depression group with aroma for 0,10 and 20 days

圖5 正常組與抑郁患者不聞香0天、10天、20天的OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA scores plot of normal group and depression group without aroma for 0,10 and 20 days

正常組與抑郁聞香組的OPLS-DA得分如圖6。抑郁癥患者組聞香干預后有傾向于正常組的趨勢，說明抗抑郁復方精油對患者的代謝物調節有一定的作用。R2X= 0.622，R2Y= 0.688，Q2=0.60，模型的穩定性和預測率較高。

圖6 正常組與抑郁患者聞香0天、10天、20天的OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA scores plot of normal group and depression group with aroma for 0,10 and 20 days

為進一步了解精油香氣干預前后志愿者代謝物的差異變化及復方精油的作用機制，采用OPLS-DA對抑郁患者聞香0天(T0)與正常組(N)、抑郁患者聞香10天(T1)、20天(T2)進行分析，并得到對應的S-Plot載荷圖，如圖7～圖12所示。結果表明T0與N、T1、T2均分離比較明顯，選取VIP>1的物質進行t檢驗(P<0.05)，確定生物標記物。

圖7 T0與N 的OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA scores plot of T0 and N

圖8 T0與N的S-plot圖Fig.8 S-plot of T0 and N

圖9 T0與T1的OPLS-DA得分圖Fig.9 OPLS-DA scores plot of T0 and T1

圖10 T0與T1的S-plot圖Fig.10 S-plot of T0 and T1

圖11 T0與T2 的OPLS-DA得分圖Fig.11 OPLS-DA scores plot of T0 and T2

圖12 T0與T2 的S-plot圖Fig.12 S-plot of T0 and T2

2.4 生物標記物鑒定

結合數據庫檢索對T0與N、T1、T2的差異代謝物進行鑒定并分析含量變化。結果發現在尿液樣本中，T0與N比較共篩選到6種化合物，T0與T1、T2對比均篩選到4種化合物。代謝物主要為氨基酸類，鑒定出的代謝標志物如表3～表5所示，其中聞香前后，有5個差異代謝物呈現上調趨勢，1個下調。

表3 T0與N 代謝標志物鑒定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多維分析得到的代謝物重要性參數；Change Trend 表示N與T0代謝物的變化趨勢?！硎綨中代謝物質含量相對T0時增加，↓表示N中代謝物質含量相對T0時減少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of N and T0metabolites.↑ indicates that the content of metabolic substances in N increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in N decreases relative to T0.

表4 T0與T1 代謝標志物鑒定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多維分析得到的代謝物重要性參數；Change Trend 表示T1與T0代謝物的變化趨勢?！硎綯1中代謝物質含量相對T0時增加，↓表示T1中代謝物質含量相對T0時減少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of T1and T0metabolites.↑indicates that the content of metabolic substances in T1increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in T1decreases relative to T0.

表5 T0與T2 代謝標志物鑒定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多維分析得到的代謝物重要性參數；Change Trend 表示T2與T0代謝物的變化趨勢?！硎綯2中代謝物質含量相對T0時增加，↓表示T2中代謝物質含量相對T0時減少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of T1and T0metabolites.↑indicates that the content of metabolic substances in T2increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in T2decreases relative to T0.

2.5 代謝通路篩選

將表4和表5鑒定出的標記物，通過Metaboanalyst的通路分析模塊對代謝通路進行鑒定，本文選擇P<0.05，Impact>0.1作為抗抑郁復方精油干預的主要代謝通路，包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及牛磺酸和亞?；撬岽x(圖13和14，表6和7)。

圖13 T0與T1代謝通路分析 Fig.13 Metabolic pathway analysis of T0 and T1注：A.?；撬岷蛠喤；撬岽x；B.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。Note:A.Taurine and hypotaurine metabolism;B.Glycine,serine and threonine metabolism.

圖14 T0與T2代謝通路分析 Fig.14 Metabolic pathway analysis of T0 and T2注：A.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；B.?；撬岽x。Note:A.Glycine,serine and threonine metabolism;B.Taurine and hypotaurine metabolism.

3 結論

芳香植物精油的香氣成分對情緒調節有良好的效果。Lima等[7]的研究表明D-檸檬烯在鼻腔與腦的傳遞途徑效率較高且在舒緩精神壓力方面有較好效應。研究發現乙酸芳樟酯和芳樟醇在緩解精神抑郁癥狀方面具有顯著作用[8]。本文通過對尿液樣本深入分析發現抗抑郁復方精油的調節代謝途徑主要涉及以下兩個方面，說明植物精油香氣對神經系統功能的正常發揮有一定的調節作用。

表6 T0與T1代謝通路分析結果

表7 T0與T2代謝通路分析結果

3.1 氨基酸代謝調節

氨基酸與生物生命活動緊密相關。甘氨酸是人體內非必要氨基酸，是中樞神經系統中的抑制性神經遞質[9]，對控制神經元興奮方面有重要作用，當其含量過多會增強NMDA受體的激動生理效應，而NMDA受體的過度激活被認為是抑郁癥發病的原因之一[10,11]；絲氨酸是膳食蛋白的組成部分，是一種重要的氨基酸，可用作磷脂中堿的前體，絲氨酸本身和絲氨酸轉化為甘氨酸調節NMDA受體均可以影響中樞系統。

3.2 ?；撬岽x調節

牛磺酸存在于人體的大腦、心臟和腎臟中，具有很多生物學調節功能，如作為神經遞質、細胞膜的穩定劑和促進鈣離子轉運等[12,13]。缺少?；撬嶙铒@著的癥狀是精神抑郁，有精神恍惚、睡眠障礙等表現。牛磺酸的含量影響了(-氨基丁酸受體及甘氨酸受體，臨床發現在幾乎所有抑郁癥患者都存在?；撬岷坎蛔愕默F象[14,15]。