西藏虎頭蘭花香成分分析

顏鳳霞，李孝絨，田 凡，王蓮輝*

1貴州省林業科學研究院，貴陽550005；2貴州大學生命科學學院，貴陽 550025

西藏虎頭蘭(CymbidiumtracyanumL.)屬于蘭科蘭屬附生型多年生草本植物，其花器官主要分為合蕊柱、唇瓣、花瓣(如圖1)，是蘭屬植物中重要的觀賞花卉之一，具有很高的觀賞價值和經濟價值[1,2]，其在中國主要分布于貴州西南部、云南西南部至東南部、西藏東南部、緬甸和泰國等海拔1 200～1 900 m 的林中樹干或分枝上[3]。花香是由各種芳香成分共同作用而形成的，實質是一類低分子量、低沸點、低極性的、具揮發性的小分子混合物，是構成和影響花卉觀賞價值的主要因素之一，香花育種一直是重要的育種目標[4]，目前在蘭屬春蘭、大花蕙蘭、建蘭、鼓槌石斛、鐵皮石斛等花卉中已有香氣成分的研究報道[5-8]。但目前未見西藏虎頭蘭花香揮發性成分和相對含量的日動態變化分析、花器官不同部位花香揮發性成分和相對含量分析的研究報道。固相微萃取技術(SPME)是一種新型無溶劑樣品預處理技術，它通過吸附/脫吸附技術，富集樣品中的揮發性和半揮發性成分，具有無需有機溶劑、所需樣品量少、靈敏度高、操作簡單、方便快捷等特點[9]。SPME與GC-MS技術聯用，集采樣、萃取、濃縮、進樣為一體，大大提高了分析速度和方法的靈敏度，這項技術已廣泛應用于花卉[10-13]、食品[14,15]等的揮發性成分檢測。

本研究中以西藏虎頭蘭為試驗材料，利用SPME結合GC-MS技術分析鑒定其盛花期花香成分、含量日變化規律及花器官不同部位花香揮發性成分和相對含量，以探索西藏虎頭蘭的特征香氣來源，為蘭屬植物中其他蘭屬植物香氣形成機制研究提供參考。

圖1 西藏虎頭蘭及其花器官解剖圖 Fig.1 C.Tracyanum and anatomical map of C.Tracyanum

1 材料與儀器

材料來源于貴州省林科院五年生組培苗開花的西藏虎頭蘭，花期9～12月，開花時長30～40天。

所用采樣及分析儀器：手動固相微萃取裝置(美國Supelco公司)，萃取纖維為；2 cm-50/30 μm

DVB/CAR/PDMS Stable Flex。HP6890/5975C氣相-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)。

2 方法

2.1 取樣方法

選擇處于盛花期(開花第7天)生長勢一致、開花正常的6株西藏虎頭蘭作為采集對象，進行花香成分測定。分別在10∶00、14∶00及18∶00取西藏虎頭蘭整朵花測定其花香成分，進行花香成分日變化動態監測；解剖西藏虎頭蘭花，并測定花瓣、唇瓣和蕊柱三個花器官的花香成分。

花香分析采用手動固相微萃取裝置(美國Supelco公司)：取混勻樣品1.5 g，置于50 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex纖維頭的手動進樣器，在50℃的平板加熱條件下頂空萃取45 min時間后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析5 min進樣。

2.2 分析條件

色譜柱為FB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫40 ℃(保留2 min)，以2.5 ℃/min升溫至160 ℃，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，運行時間：58 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓6.88 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間：1 min。

離子源為EI源，溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 800 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。

2.3 定性定量分析

對總離子流圖中的各峰經質譜用計算機數據系統檢索及核對Nist 14和Wiley275中標準質譜圖，確定揮發性化學成分，用峰面積歸一化法測定西藏虎頭蘭鮮花活體花香各化學成分的相對質量分數及其相對含量。

3 結果與分析

3.1 西藏虎頭蘭盛花期花香日變化規律分析

經GC-MS分析西藏虎頭花盛花期10∶00、14∶00和18∶00這3個時間點花香釋放的總離子流圖(圖2)，扣除本底雜質后，從西藏虎頭花盛花期花朵釋放的花香中共鑒定出揮發性成分89種。

從表1可以看出，在西藏虎頭蘭10點時，鑒定出揮發性成分88種，其中萜烯類化合物最多26種，百分含量最大，占到總量的46.821%，其次為醇類14.540%、醛類7.057%、酚類11.01%、酮類6.676%、呋喃類2.255%、醚類1.90%和芳香族化合物1.18%等；主要化學物質依次是化合物α-蒎烯，松萜占最大16.33%，檜烯4.46%、β-蒎烯6.37%、DL-檸檬烯5.98%、對甲酚9.49%等。14點時，鑒定出揮發性成分87種，其中萜烯類化合物最多25種，百分含量最大占到總量的57.121%，其次為醇類9.473%、醛類5.294%和酚類14.189%等；主要化學物質依次是α-蒎烯，松萜占最大18.813%，香檜烯5.898%、β-蒎烯7.481%、DL-檸檬烯8.547%、α-松油烯5.544%、對甲酚13.858%等。在18點時，鑒定出揮發性成分83種，其中萜烯類化合物最多24種，百分含量最大占到總量的45.83%，其次為醇類13.128%、醛類9.629%和酚類16.039%等；主要化學物質依次是對甲酚占最大15.932%，α-蒎烯，松萜占15.317%、檜烯3.977%、β-蒎烯6.156%、DL-檸檬烯5.971%、α-松油烯3.254%等。

圖2 西藏虎頭蘭盛花期日變化花香成分總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of aromatic constituents from C.tracyanum of diurnal variation注：A∶10∶00；B∶14∶00；C∶18∶00。

表1 西藏虎頭蘭日變化花香成分種類及相對含量

續表1(Continued Tab.1)

類型Type化合物Compound保留時間tR(min)相對含量 Relative content10∶0014∶0018∶00萜烯類Terpene1,3-戊二烯 1,3-Pentadiene1.8610.010.0550.0472-丁烯 2-Butenone2.1820.020.0190.013(Z)-3-甲基-1,3-戊二烯 (Z)-3-Methyl-1,3-pentadiene2.6220.070.0750.028三環烯,三環萜 Tricyclene10.6250.010.0120.008α-崖柏烯 α-Thujene10.9742.202.7092.133α-蒎烯松萜 α-Pipene11.35816.3318.81315.317莰烯 Camphene11.9560.120.1210.069檜烯 Sabinene13.4664.465.8983.977β-蒎烯 β-Pinene13.5276.377.4816.156β-月桂烯 β-Myrcene14.4310.521.0621.779α-水芹烯 α-Phellandrene15.0510.210.2770.598α-松油烯 α-Terpinene15.7250.610.7510.647對傘花烴 p-Cymene16.2570.210.2620.33DL-檸檬烯 DL-Limonene16.495.988.5475.9713-乙基-2-甲基-1,3-己二烯3-Ethyl-2-methyl-1,3-hexadiene16.5951.440.9852.402γ-松油烯 γ-Terpinene18.1581.241.5341.012反式檜烯水合物 trans-Sabinene hydrate18.8720.180.1310.175α-松油烯 α-terpinolene19.843.515.5443.254對聚傘花烯 p-Cymenene20.040.160.1250.021,3,8-p-孟三烯1,3,8-p-Menthatriene21.2160.220.148-反式-檸檬烯氧化物 trans-Limonene oxide22.7130.14--δ-欖香烯 δ-Elemene33.5110.020.0450.031β-欖香烯 β-Elemene36.4050.400.4050.316(E)-β-法呢烯 (E)-β-Famesene39.6740.030.0370.02瓦倫烯 Valencene41.1341.381.1730.844α-芹子烯 α-Selinene41.5390.980.9120.683合計 Total46.821 57.12145.83酮類Ketone2-丁酮 2-Butanone 2.2330.060.090.0351-戊烯-3-酮 1-Penten-3-one3.1510.000.030.0053-戊酮 3-Pentanone3.3440.840.8760.8973辛酮 3-Octanone14.190.720.4660.626-甲基-5-庚烯-2-酮 6-Methyl-5-hepten-2-one14.2380.670.9181.455馬鞭草烯酮 Verbenone26.8423.521.6910.709香葉基丙酮 Geranyl acetone39.5240.040.0360.018六氫呋喃丙酮 Hexahydrofarnesyl acetone53.6280.010.0070.0032-己烷酮 2-Heptadecanone54.3430.820.3410.371合計 Total6.676 4.4554.113酯類Ester乙酸甲酯 Methyl acetate1.8730.030.0070.028壬內酯 Nonlacton35.2520.140.0530.071

續表1(Continued Tab.1)

類型Type化合物Compound保留時間tR(min)相對含量 Relative content10∶0014∶0018∶00棕櫚酸甲酯 Methyl palmitate54.5810.020.020.025合計 Total0.19 0.080.124酚類Phenol愈創木酚 Guaiacol20.4670.340.194-對甲酚 p-Cresol21.6849.4913.85815.932對-甲氧甲酚 p-Creosol26.3191.180.1370.107合計 Total11.01 14.18916.039呋喃類Furan2-甲基呋喃 2-Methylfuran2.2830.010.0080.012-乙基呋喃 2-Ethylfuran3.4160.020.0510.1022,4-二甲基呋喃 2,4-Dimethylfuran3.6550.010.0280.0192-丁基呋喃 2-Butylfuran9.3790.080.0810.1242-戊基呋喃 2-Pentylfuran14.472.131.9052.57合計 Total2.255 2.0732.825醚類Ether對甲基苯甲醚 p-Methylanisole16.1571.52 0.8310.642藜蘆醚 Veratrol23.5660.38 0.4430.139合計Total1.90 1.2740.781芳香族化合物Aromatic3,4-二甲氧基甲苯 3,4-Dimethoxytoluene28.7030.290.038-3,5-二甲氧基甲苯 3,5-Dimethoxytoluene30.1470.890.3740.938合計 Total1.18 0.4120.938烷烴類Alkane十四烷 Tetradecane36.8260.030.009-十六烷 Hexadecane46.4510.020.010.007(正)十七(碳)烷 Heptadecane50.8040.030.023-合計 Total0.08 0.0420.007

注：“-”表示未檢測到或不存在。

Note:“-” means that it is not detected or does not exist.

3.2 西藏虎頭蘭不同花器官花香變化規律分析

圖3為西藏虎頭花盛花期不同花器官花香釋放的總離子流圖，扣除本底雜質后，從西藏虎頭花盛花期花瓣、唇瓣及合蕊柱釋放的花香中共鑒定出揮發性成分86種(表2)，由萜烯類、醇類、醛類、酮類、酯類、芳香族類、烷烴類、醚類、呋喃類、酚類十大類組成。

從表2可以看出，西藏虎頭蘭花香揮發性成分在花瓣中72種、唇瓣中66種及合蕊柱中62種，由花瓣到唇瓣到合蕊柱呈遞減過程。花瓣中，萜烯類化合物最多22種，相對含量最大占到總量的64.223%，其次為醇類9.147%、酮類5.19%、酚類9.573%、醛類2.512%、呋喃類0.15%、烷烴類0.06%、酯類0.123%、醚類0.331%和芳香族化合物0.546%；主要化學物質是α-蒎烯，松萜占比30.242%最大，其次β-蒎烯12.502%、對甲酚9.53%、檜烯6.049%、DL-檸檬烯6.081%等。唇瓣中，也是萜烯類化合物最多18種，百分含量最大占到總量的43.854%，其次為醇類12.063%、醛類8.685%、酚類16.928%、酮類5.648%、呋喃類3.652%、烷烴類0.032%、醚類0.869%、酯類0.107%和芳香族化合物0.145%；主要化學物質是對甲酚占比最大16.172%，其次α-蒎烯，松萜3.103%、α-松油烯15.160%、1-己醇4.975%和DL-檸檬烯11.613%等。合蕊柱中，萜烯類、醛類及醇類化合物最多，都為14種，百分含量分別為10.851%、16.504%、26.699%，酮類4.842%、烷烴類0.086%、酯類0.09%、醚類1.282%、呋喃類3.934%及芳香族化合物0.271%；主要化學物質依次是對甲酚占比最26.804%，己醛5.264%、1-己醇15.747%，(E)-2-辛烯醛4.606%、而α-蒎烯，松萜百分含量降低到0.582%。

圖3 西藏虎頭蘭不同花器官花香成分總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of aroma components of different floral organs of C.tracyanum注：A：花瓣；B：唇瓣；C：合蕊柱。Note:A:Petal;B:Labellun;C:Gynandrium.

表2 西藏虎頭蘭花不同器官花香成分及相對含量

續表2(Continued Tab.2)

類型Type化合物Compound保留時間tR(min)相對含量Relative content花瓣Petal唇瓣Labellun合蕊柱Gynandrium(E)-2-己烯醛 (E)-2-Hexenal7.9930.010.0730.328庚醛 Heptanal9.8460.0180.2950.633(E)-2-庚烯醛 (E)-2-Heptenal12.6730.0490.3911.040辛醛 Octanal15.0870.1790.5741.633苯基乙醛 Phenylethanal17.6230.0540.2270.216(E)-2-辛烯醛 (E)-2-Octenal18.2470.1771.6534.606壬醛 Nonanal20.8310.2231.4970.645β-半環檸檬醛 β-Cyclocitral27.2470.2680.0550.051合計 Total2.5128.68516.504萜烯類 Terpene1,3-戊二烯 1,3-Pentadiene1.8510.0020.0440.0092-丁烯 2-Butenone2.1720.0350.0050.005三環烯,三環萜 Tricyclene10.6270.014--α-崖柏烯 α-Thujene10.9652.8891.1930.358α-蒎烯,松萜 α-Pipene11.31830.2423.1030.582莰烯 Camphene11.9740.1--檜烯 Sabinene13.4146.0492.2050.461β-蒎烯 β-Pinene13.50412.5020.7590.461β-月桂烯 β-Myrcene14.4210.8710.943-α-水芹烯 α-Phellandrene15.0580.3670.341-α-松油烯 α-Terpinene15.7320.4791.0570.368對傘花烴 p-Cymene16.2190.1551.1610.474DL-檸檬烯 DL-Limonene16.4466.08111.6131.8893-乙基-2-甲基-1,3-己二烯 3-Ethyl-2-methyl-1,3-hexadiene16.5570.4352.6403.756γ-松油烯 γ-Terpinene18.160.7112.5200.394反式檜烯水合物 trans-Sabinene hydrate18.8640.1710.236-α-松油烯 α-terpinolene19.8010.71815.1602.023對聚傘花烯 trans-Sabinene hydrate20.063-0.402-1,3,8-P-孟三烯 p-Cymenene21.242-0.3280.056反式-檸檬烯氧化物 trans-Limonene oxide22.712-0.144-δ-欖香烯 δ-Elemene33.5040.041--β-欖香烯 β-Elemene36.3990.356--(E)-β-法呢烯 (E)-β-Famesene39.6760.041--瓦倫烯 Valencene41.121.078--α-芹子烯 α-Selinene41.5230.886-0.015合計64.22343.85410.851醇類Alcohol乙醇 Ethanol1.6640.3530.4071.265丙醇 Propanol2.042-0.0090.0071-戊烯-3-醇 1-Penten-3-ol3.2170.1260.4070.455

續表2(Continued Tab.2)

類型Type化合物Compound保留時間tR(min)相對含量Relative content花瓣Petal唇瓣Labellun合蕊柱Gynandrium3-甲基-1-丁醇 3-Methyl-1-butanol4.2190.0130.0140.0391-戊醇 1-Pentanol5.0420.2431.0461.189(Z)-2-戊烯醇 (Z)-2-Pentenol5.1860.1390.7330.897順式-3-己烯醇 cis-3-Hexenol8.1290.3291.2481.8941-己醇 1-Hexanol8.7131.1774.97515.747(E)-2-辛烯醇 (E)-2-Octenol19.263-1.0240.933辛醇 Octanol19.3550.1970.7572.773芳樟醇 Linalool20.8641.162--苯乙醇 Benzeneethanol22.120.5720.8501.1184-萜品醇 4-Terpineol25.1160.2760.5770.343丁香醇A Lilac alcohol A27.0951.729--欖香醇 Elemol44.3971.599-0.011反式橙花叔醇 trans-Nerolidol44.9860.248--γ-桉葉醇 γ-Eudesmol48.120.125--β-桉葉醇 β-Eudesmol49.0370.3330.0160.028α-桉葉醇 α-Eudesmol49.1290.526--合計 Total9.14712.06326.699酮類 Ketone2-丁酮 2-Butanone 2.2230.2580.0060.0071-戊烯-3-酮 1-Penten-3-one3.1960.0220.0560.3033-戊酮 3-Pentanone3.3420.6461.8991.9903辛酮 3-Octanone14.2110.263.5662.3156-甲基-5-庚烯-2-酮 6-Methyl-5-hepten-2-one14.2520.761--馬鞭草烯酮 Verbenone26.6931.9870.0540.215香葉基丙酮 Geranyl acetone39.5550.039--六氫呋喃丙酮 Hexahydrofarnesyl acetone53.6280.0060.0190.0122-己烷酮 2-Heptadecanone54.3421.2110.0480.062合計 Total5.195.6484.842呋喃類 Furan2-甲基呋喃 2-Methylfuran2.295-0.0040.0042-乙基呋喃 2-Ethylfuran3.416-0.1980.0922,4-二甲基呋喃 2,4-Dimethylfuran3.6430.13--2-丁基呋喃 2-Butylfuran9.3750.020.1840.2652-戊基呋喃 2-Pentylfuran14.4412.0713.2663.573合計 Total0.153.6523.934烷烴類Alkane辛烷 Octane5.7240.03--十三烷 Tridecane31.62--0.057十五烷 Pentadecane41.761-0.0160.029十六烷 Hexadecane46.469-0.016-(正)十七(碳)烷 Heptadecane50.8160.037--

續表2(Continued Tab.2)

類型Type化合物Compound保留時間tR(min)相對含量Relative content花瓣Petal唇瓣Labellun合蕊柱Gynandrium合計 Total0.0670.0320.086酯類 Ester乙酸甲酯 Methyl acetate1.8660.0150.0450.081壬內酯 Nonlacton35.455-0.055-棕櫚酸甲酯 Methyl palmitate54.4560.1080.0070.009合計 Total0.1230.1070.09芳香族化合物Aromatic3,4-二甲氧基甲苯 3,4-Dimethoxytoluene28.753-0.0700.1573,5-二甲氧基甲苯 3,5-Dimethoxytoluene30.1360.5460.0750.114合計 Total0.5460.1450.271

注：“-”表示未檢測到或不存在。

Note:“-” means that it is not detected or does not exist.

綜上，西藏虎頭蘭鮮花全花的花香成分共89種，包括醛類、醇類、酮類、酯類、萜烯類、烷烴類、醚類、喃類、酚類及芳香族化合物十類。在一天中不同時間點花香成分都包括以上十個類別，但有一定差異，總數在減少，其中10∶00時花香種類88種、14∶00時87種、18∶00時83種；14點比10點少了一種反式-檸檬烯氧化物，18點出現了一種新物質(E)-2-壬烯醛；對于主要物質相對含量從10點到18點α-蒎烯，松萜相對含量先上升后下降，14點出現最高18.813%，而對甲酚呈現上升趨勢，18點時最高15.932%，這些成分的相對含量均表現出明顯的日變化，但萜烯類物質、醇類物質和酯類物質無論數量還是相對含量都占有很大比重，說明萜烯類物質、醇類物質和酯類物質是西藏虎頭蘭花香的主要成分。

西藏虎頭蘭各花器官花香組成成分不同，其中花瓣花香成分72種、唇瓣66種，合蕊柱62種，萜烯類物質、醇類物質和酯類物質在三個花器官中相對含量都占有很大比重。但含量有差異，花瓣中α-蒎烯，松萜占比30.242%最大，其次β-蒎烯12.502%、對甲酚9.53%、檜烯6.049%、DL-檸檬烯6.081%；唇瓣中對甲酚占比最大16.172%，α-蒎烯，松萜3.103%、α-松油烯15.160%、1-己醇4.975%和DL-檸檬烯11.613%；合蕊柱中對甲酚占比最26.804%，己醛5.264%、1-己醇15.747%、(E)-2-辛烯醛4.606%、α-蒎烯、松萜0.582%；相對含量最大的α-蒎烯、松萜從花瓣到合蕊柱逐漸降低，對甲酚呈上升趨勢。結果說明花瓣為西藏虎頭蘭主要的釋香花器官。

4 討論與結論

花香是由各種揮發性成分共同作用形成的，各成分對花香的貢獻可以通過其香氣值(含量/嗅感閾值)衡量，具有較高香氣值的成分可作為花的特征香氣[16，17]。本研究利用快捷、簡單、無溶劑的頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對西藏虎頭蘭鮮花的香氣成分進行了分析鑒定。

西藏虎頭蘭鮮花全花的花香成分共89種，包括醛類、醇類、酮類、酯類、萜烯類、烷烴類、醚類、喃類、酚類及芳香族化合物十類。全花主要花香成分為α-蒎烯，松萜、對甲酚、DL-檸檬烯、β-蒎烯、檜烯、α-松油烯；α-蒎烯，松萜相對含量先上升后下降，14點出現最高18.813%，而對甲酚呈現上升趨勢，18點時最高15.932%。

西藏虎頭蘭花器官的花香成分存在差異，且花瓣為主要的釋香花器官。花瓣主要香氣成分α-蒎烯，松萜、β-蒎烯、對甲酚、檜烯、DL-檸檬烯；唇瓣主要香氣成分對甲酚、α-蒎烯，松萜、α-松油烯、1-己醇、DL-檸檬烯；合蕊柱主要香氣成分對甲酚、己醛、1-己醇、(E)-2-辛烯醛，主要物質種類有明顯差異，但花香成分無論是日變化或不同花器官中萜烯類物質、醇類物質和酯類物質無論數量還是相對含量都占有很大比重。在方永杰等對蕙蘭普通花型進行香氣成分檢測，認為萜烯類化合物是蕙蘭的主要香氣成分[7]。魏丹等對浙江產蕙蘭鮮花進行芳香成分分析，其主要香氣成分依次是醇類、烷烴和萜烯類，主要香氣物質為桉油精和(E)-己基葵烯炔等[13]。因此可以確定萜烯類物質、醇類物質和酯類物質為西藏虎頭蘭的主要花香成分。這些花香成分的協同作用形成了西藏虎頭蘭特有的香氣，這特有的花香也是影響其獨特的觀賞價值因素之一。揮發性物質的留香時間與揮發物分子的大小和復雜度成正比[18]，西藏虎頭蘭的香氣組分種類較多，分子較大并且結構復雜，各組分留香時間普遍較長且各不相同，這可能是其香氣清新悠遠的主要原因之一。

總之，西藏虎頭蘭花香的釋放隨一天中不同的時間點及不同的花器官，表現出規律性的變化，而這種變化最終受到的花香各成分生物合成的調控， 因此探索花香物質生物合成在一天中不同時間點的變化及在花器官上的變化，是揭示花香釋放規律性變化的關鍵，而其花香物質的合成或停止合成如何受發育階段和環境條件的協同調節仍需進一步研究探索。