三株海南島野生靈芝的鑒定、多糖組成及其抗氧化活性研究

金 鑫，熊 川，李 萍，李 強，陳祖琴，張 璐，黃文麗*

1四川省農業(yè)科學院生物技術核技術研究所，成都 610061；2成都大學藥學與生物工程學院，成都 610106

靈芝(GanodermalingzhiSheng H.Wu,Y.Cao & Y.C.Dai)是擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬真菌[1,2]，為我國名貴傳統(tǒng)中藥材，已有2 000多年的應用研究歷史，最早《神農本草經》認為靈芝具有益氣強身、扶正固本、延年益壽等功效，現(xiàn)代研究表明靈芝主要活性物質有多糖、三萜類、甾醇類、氨基酸、核苷、蛋白質等[3]，其中靈芝多糖是最主要的藥效成分[4-6]，目前已經從不同來源的靈芝材料中分離獲得200多個多糖組分，其中大部分為葡聚糖，單糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖等[7,8]。大量的臨床試驗表明靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調節(jié)、降血脂、降血糖、抗菌解毒等作用[9-13]。

近年來靈芝的研究越來越熱，人們對野生靈芝資源的需求不斷增大，導致野生資源越來越匱乏，而野生靈芝品種的馴化研究是資源利用中重要的一環(huán)。在這種形勢下，對靈芝野生資源種類的正確認識以及活性研究有著積極的意義，目前，雖然對海南島野生靈芝的研究已有一些報道[14,15]，但是研究集中在資源分類和分離馴化，還沒有對海南島野生靈芝子實體多糖的組成和活性研究的報道。本研究首先對三株海南野生靈芝子實體進行形態(tài)和分子鑒定；其次通過HPLC分析了子實體多糖的單糖組成；最后測定多糖的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力進行抗氧化活性評價。鑒定海南島的野生靈芝資源和深入研究其活性是重要的基礎工作，本研究以期為海南島野生靈芝資源的保護利用或深入研究其多糖活性提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

樣品采集于海南島五指山國家級自然保護區(qū)，三株靈芝分別編號為HN-1、HN-2和HN-3。

1.1.2 試劑

三氟乙酸(TFA)、乙酸銨、乙腈(Merck，德國)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析純(Sigma，美國)、DNA提取試劑盒(OMEGA公司的D3390-02 E.Z.N.A.TM Fungal DNA Kit 試劑盒)、葡萄糖(Glc，≥98%)、D-木糖(Xyl，98%)、D-半乳糖(Gal，≥99%)、D-甘露糖(Man，≥98%)、核糖(Rib，>98%)、D-鼠李糖(Rha，≥98%)等標準品(成都普思生物科技股份有限公司)，其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.3 儀器

紫外分光光度計(Molecular Devices美國)，旋轉蒸發(fā)儀(Eyelaosb 2000日本)，冷凍干燥機(CHRIST Beta 2-8 LSCplus德國)，高效液相色譜儀(Perkinelmer CT 06484美國)，全波長掃描酶標儀(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取、擴增及測序

將子實體表面用無菌水清洗干凈，取2 g子實體用液氮研磨，采用試劑盒提取DNA，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對DNA進行擴增，擴增條件參考文獻[16]，擴增樣品送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.2 靈芝子實體粗多糖的提取將

靈芝子實體于60 ℃下烘干，粉碎。稱取50.0 g靈芝子實體粉末，按料液比1∶30(W/V)加入蒸餾水，90 ℃水浴提取3 h，提取2次，合并濾液，50 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至約30 mL，經過3 000 Da膜過濾，向溶液中加入其體積1/3的Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇)=4∶1)混合震蕩后靜置30 min，5 000 rpm，離心10 min，除去有機層及水層和有機層交界處的變性蛋白質，重復多次至無蛋白質產生。除蛋白后的多糖，再經過95%酒精醇沉，最后5 000 rpm離心10 min去上清，冷凍干燥保存，多糖含量采用苯酚-硫酸法測定[17]。

1.2.3 混合單糖標樣的衍生

單糖混合標準溶液與靈芝多糖按Feng等[18]的方法并做改進，進行柱前衍生化后進行HPLC分析；其中單糖混合標準溶液為D-甘露糖(D-mannose，Man)、D-木糖(D-xylose，Xyl)、L-鼠李糖(L-rhamnose，Rha)、D-葡萄糖(D-glucose，Glc)、D-半乳糖(D-galactose，Gal)、核糖(ribose，Rib)、D-阿拉伯糖(D-arabinose，arab)、L-巖藻糖(L-fucose，F(xiàn)uc)標準品，分別配成5 mg/mL，同等體積混合。分別取300 μL的混合單糖標準液與300 μL 0.6 mol/L NaOH溶液，置于2 mL的離心管中并混合均勻；再取150 μL的混合液于5 mL的具塞刻度試管中，加150 μL 0.5 mol/L的PMP(0.435 5 g/5 mL)甲醇溶液，漩渦混勻；在70 ℃烘箱中反應120 min；取出放置10 min冷卻至室溫；加150 μL 0.3 mol/L的HCl中和；再加水至3 mL，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.2 μm微孔膜過濾后供HPLC進樣分析。

1.2.4 多糖衍生樣品制備

吸取300 μL質量濃度為5 mg/mL的多糖樣品溶液于5 mL的具塞刻度試管中，加入300 μL的4 mol/LTFA，充N2封管，110 ℃烘箱中水解70 min；取出室溫放置10 min，冷卻后打開蓋，加600 μL甲醇后用N2吹干，如此重復加甲醇并用N2吹3次，去除溶液中的TFA；再加入150 μL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘渣，再加150 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，同樣在70 ℃的烘箱中反應120 min，冷卻后按“1.2.3”進行中和和萃取，最后用0.2 μm微孔膜過濾。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽(pH 6.7)，緩沖液-乙腈，體積比為83∶17；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：50 μL。

1.2.6 靈芝多糖對DPPH的清除作用

參照Feng[18]和Feng[19]的方法，略作修改。稱取一定質量的粗多糖，分別配成不同質量濃度(0、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL)的粗多糖水溶液各10 mL。各取0.5 mL的樣品，分別加入0.5 mL 0.04 mg/mL的DPPH的乙醇溶液，在振蕩器上混勻30 s，后放入25 ℃烘箱中避光反應30 min，用酶標儀517 nm處測定其吸光值(A)。空白組用0.5 mL去離子水代替樣品，對照組用0.5 mL無水乙醇溶液，陽性對照為不同濃度的維生素C。三次重復取平均值。

式中：A空白為空白組吸光值；A對照為對照組吸光值；A樣品為樣品組吸光值，下同。

1.2.7 對羥基自由基的清除作用

參照Zhang[20]和Ma等[21]方法，進行了部分修改。分別取1.2.6方法中配制好的不同質量濃度的多糖溶液1 mL于試管中，向各管中加入新鮮配制的硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)和水楊酸溶液(6 mmol/L)各0.3 mL，在振蕩器上混勻30 s，之后加入0.1%的過氧化氫溶液0.3 mL，繼續(xù)振蕩混勻30 s，37 ℃烘箱中反應30 min，酶標儀510 nm處測定吸光值。空白組以去離子水代替多糖樣品，陽性對照為不同濃度的Vc。三次重復取平均值

1.2.8 對超氧陰離子的清除作用

參照Ma[21]和Han[22]的方法，進行適當修改。選取10 mL的具塞試管，向各管中加入50 mmol/L pH為8.2的磷酸鹽緩沖液0.9 mL，在25 ℃烘箱中靜置30 min，再向各試管中加入0.2 mL“1.2.6”中配制好的不同質量濃度的多糖樣品，然后加入25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.08 mL，振蕩器上混勻30 s，25 ℃烘箱中避光反應10 min，再加入濃度為80 mmol/L的HCl 0.2 mL，水浴搖床反應5 min，搖床轉速為180 rpm，然后在酶標儀420 nm處測定吸光度值。空白組以去離子水代替多糖樣品，對照組為80 mmol/L HCl代替鄰苯三酚，陽性對照為不同濃度的Vc。三次重復取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 野生靈芝形態(tài)鑒定和系統(tǒng)進化分析

將HN-1、HN-2和HN-3子實體樣品的ITS測序序列上傳NCBI，分別獲得序列號MK968730、MK968731、MK968732，同時將其測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，同時在GenBank中尋找同源性最大的序列，每個樣品各找4條與之對應相似的同源序列(相似度≥99%)，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時以假芝(Amaurodermasubrugosum)為外參。從圖1中可以看出，HN-1、HN-2和HN-3都屬于靈芝種，但處于不同的分支上，與赤芝(G.lingzhi)距離較遠。HN-1與KT318604.1(G.sinense)相似度非常高，相似性≥99%；HN-2與KT318590.1(G.australe)相似度≥99%；HN-3與JX840350.1(G.mastoporum)相似度≥99%。

三株野生靈芝子實體性狀和生境見表1，三株野生靈芝子實體形態(tài)圖(見圖2)，通過ITS序列分析和形態(tài)鑒定，可確定HN-1為紫芝(G.sinense)，HN-2為南方靈芝(G.australe)，HN-3為無柄紫靈芝(G.mastoporum)。

表1 三株野生靈芝子實體性狀和生境

續(xù)表1(Continued Tab.1)

樣品SampleHN-1HN-2HN-3菌蓋背面Back純白色,能看到細小的微孔白色,有微孔但不明顯褐色,較光滑菌柄長度Length of stipe(cm)菌柄較細長18.5無菌柄無菌柄菌柄形狀Stipe shape紫褐色,光滑無菌柄無菌柄菌肉顏色、味道Color and taste of mushroom meat褐色,無苦味新鮮菌肉淺褐色,木栓質,干燥后變?yōu)樯詈稚?苦味較濃菌肉暗褐色,木栓質,微苦味生境Habitat混交林里,以闊葉樹、竹子為主,潮濕生長在活榕樹上,所生長地位為斷枝處,有一個狹窄的柄基生長在臥倒的腐木上相似物種Similar species紫芝(G.sinense)南方靈芝(G.australe)無柄紫靈芝(G.mastoporum)

2.2 多糖含量及多糖電鏡分析

表2為三種靈芝子實體的多糖提取率數(shù)據(jù)，從表中可以看出HN-1的多糖提取率最高，為2.39%±0.05%，其次為HN-3，最低的為HN-2，三者之間的多糖提取率存在顯著差異(P<0.05)。

將干燥后的多糖放大50倍電鏡掃描，圖3為HN-1、HN-2和HN-3的多糖電鏡掃描結果。目前，對于多糖表面結構的表征，還沒有統(tǒng)一標準，但電鏡掃描結果可顯示樣品的部分表面結構，從中可以比較不同樣品間多糖結構的差異。可觀測到HN-1和HN-2多糖能較好的均勻分散開，呈現(xiàn)塊狀，塊狀中均存在空洞和凹槽，而HN-3同樣呈現(xiàn)塊狀，但不能較好的分散開，塊狀較致密；HN-1的塊狀多糖部分表面光滑、部分表面出現(xiàn)絨毛狀，HN-2的塊狀多糖表面大部分為絨毛狀、小部分表面光滑，而HN-3的塊狀多糖大部分表面光滑，只有斷裂處出現(xiàn)少量絨毛。可見，三種多糖組分表面結構存在一定的差異。

圖2 3種野生靈芝形態(tài)圖Fig.2 three species of wild Ganoderma 注：A-1：HN-1正面，A-2：HN-1背面；B-1 HN-2正面：B-2：HN-2背面；C-1 HN-3正面：C-2：HN-3背面。Note:A-1:HN-1 front,A-2:HN-1 back;B-1 HN-2 front:B-2:HN-2 back;C-1 HN-3 front:C-2:HN-3 back.

表2 多糖提取率

注：不同小寫字母表示不同靈芝多糖含量間具有顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters indicate significant differences between differentGanodermapolysaccharide contents (P<0.05),the same below.

圖3 靈芝多糖掃描電鏡(50×)Fig.3 Ganoderma polysaccharide scanning electron microscope (50 ×).注：A：靈芝HN-1，B：靈芝HN-2，C：靈芝HN-3。Note:A：HN-1，B：HN-2，C：HN-3.

2.3 靈芝多糖的單糖組成

2.3.1 標準單糖的PMP衍化分析

將各單糖標準品的混合標樣衍生化，并進行HPLC分析，結果見圖4。由圖4可知各單糖標準品的PMP衍生物實現(xiàn)了良好的分離。

2.3.2 各種單糖標準品的線性關系

分別各取單糖的標準溶液10、25、50、100、150 μL稀釋至500 μL進行HPLC分析。根據(jù)各單糖的質量濃度對應的峰面積進行線性回歸分析，進而獲得各單糖的回歸方程。結果表明，8種單糖標準品在相應濃度范圍內線性關系均較好，結果如表3。

2.3.3 靈芝多糖組分的水解產物PMP衍生物分析

同單糖標準品衍生物的色譜圖進行對照分析，HN-1多糖含有甘露糖、木糖和鼠李糖；HN-2多糖含有甘露糖和葡萄糖；HN-3多糖含有甘露糖、木糖和葡萄糖(見圖5)。

通過對照標準單糖的線性回歸方程，可以計算樣品中各單糖的摩爾比，具體數(shù)據(jù)見表4。三株海南野生靈芝子實體其多糖的單糖組成都不相同，但都含有相同的甘露糖成分。

圖4 8種單糖標準品混合物高效液相色譜圖Fig.4 HPLC of eight monosaccharide standard mixtures注：1：甘露糖；2：木糖；3：鼠李糖；4：葡萄糖；5：半乳糖；6：核糖；7：阿拉伯糖；8：巖藻糖。Note：1:Mannose;2:Xylose;3:Rhamnose;4:Glucose;5:Galactose;6:Ribose;7:Arabinose;8:Fucose.

2.4 多糖抗氧化活性分析

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力

以VC作為陽性對照，三株海南野生靈芝多糖(HN-1、HN-2、HN-3)對DPPH的清除能力均隨其濃度的升高而增大(圖6)，在濃度和清除率之間有著良好的正相關關系，當多糖濃度為0.25 mg/mL時，三株靈芝多糖清除率均在35%左右，隨著濃度的逐漸上升，HN-1多糖的清除率明顯高于其他兩組；當多糖濃度達到5 mg/mL，HN-1的清除率為84.68%，HN-2為76.36%，HN-3為81.68%，但仍顯著低于Vc(P<0.05)；IC50值越小，其抗氧化活性的能力越好，從下表5的IC50值可以看出，HN-1的IC50值最小，其清除DPPH能力最強，其次為HN-3和HN-2的清除DPPH能力最低。

表3 8種單糖的回歸方程和相關系數(shù)

表4 靈芝多糖單糖組成及摩爾比

圖5 三種靈芝多糖高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of three kinds of Ganoderma polysaccharides注：A(HN-1)，1：甘露糖，2：木糖，3：鼠李糖；B(HN-2)，1：甘露糖，2：葡萄糖；C(HN-2)，1：甘露糖，2：木糖，3：葡萄糖。Note:A(HN-1),1:Mannose,2:Xylose,3:Rhamnose;B(HN-2),1:Mannose,2:Glucose;C(HN-2),1:Mannose,2:Xylose,3:Glucose.

圖6 不同靈芝多糖對DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of different Ganoderma polysaccharides on DPPH

2.4.2 對羥基自由基的清除能力

三株野生靈芝子實體多糖清除·OH-的活性與多糖濃度存在不同程度的依賴關系，見圖7。在多糖質量濃度為0.25和0.5 mg/mL時，三種靈芝多糖對·OH-的清除率差異較小，處在28%～35%之間，清除率大小順序為HN-1>HN-3>HN-2；當多糖質量濃度達到1時，清除率都顯著上升，HN-3的清除率最高，達到了66.34%，而HN-1和HN-2的清除率基本相同；當多糖質量濃度分別為2和5 mg/mL時，HN-1的清除率升高幅度明顯大于HN-1和HN-3，清除率順序都為HN-1>HN-3>HN-2。從下表5中可以看出，HN-1和HN-3的IC50值不存在顯著差異(P>0.05)，說明HN-3和HN-1對·OH-的清除能力顯著優(yōu)于HN-2(P<0.05)。

2.4.3 對超氧陰離子的清除能力

三種靈芝子實體多糖對超氧自由基清除活性同樣隨著多糖質量濃度的提高而增加(圖8)，當多糖濃度從0.25 mg/mL提高到2 mg/mL時，HN-1、HN-2和HN-3的清除率都顯著上升，當多糖濃度從2 mg/mL提高到5 mg/mL時，三種多糖的清除率升高幅度較小。從表5中可以看出，HN-1、HN-2和HN-3的IC50相互間存在顯著差異(P<0.05)，HN-1的IC50最低，其對超氧自由基清除活性顯著高于其他兩種多糖。當多糖質量濃度達到5.0 mg/mL時，HN-1的清除率為78.62%，HN-2的清除率為69.54%，HN-3的清除率為72.35%，但仍顯著低于Vc。

圖7 不同靈芝多糖對羥基自由基的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of different Ganoderma polysaccharides on hydroxyl radica

3 討論

3.1 野生靈芝的鑒定分析

海南島屬于熱帶和亞熱帶雨林氣候，其獨特的氣候優(yōu)勢為野生靈芝生長提供了適宜的溫度和濕度，同時豐富的原始森林為靈芝生長提供了充足的營養(yǎng)。目前，海南島已記載有分布的靈芝屬資源達78種之多[15]，其中野生靈芝資源有28種[23,24]，是我國野生靈芝分布最豐富的地區(qū)之一，本研究對采集于海南島的三株野生靈芝進行了形態(tài)鑒定和分子鑒定，HN-1鑒定為紫芝(G.sinense)，HN-2鑒定為南方靈芝(G.australe)，HN-3鑒定為無柄紫靈芝(G.mastoporum)，三株野生靈芝的鑒定結果同Wen[15]對采集于海南島的7種野生靈芝的形態(tài)與分子鑒定結果相似。

表5 不同多糖對自由基清除的半抑制濃度

圖8 不同靈芝多糖對超氧陰離子的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of different Ganoderma polysaccharides on superoxide anion

3.2 靈芝多糖的單糖組成差異分析

多糖是靈芝主要活性成分之一，多糖的分子結構和空間構象常常攜帶著大量的生物學信息，在生物體的中發(fā)揮著至關重要的作用，它是由單一或多種單糖聚合而成的高分子化合物。大量學者對靈芝多糖的單糖組成和含量進行了研究，Yang等[25]從靈芝子實體中分離得到2個多糖組分，且其單糖組成存在較大的差異；Zhang[26]對不同靈芝孢子粉的多糖組成進行分析，發(fā)現(xiàn)其單糖組成主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖組成，各單糖含量存在顯著差異；Xu[27]研究發(fā)現(xiàn)多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖組成，同時表明多糖的抗氧化活性與單糖組成存在密切相關，另外還有研究發(fā)現(xiàn)靈芝子實體中多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成，而菌絲體和孢子粉中多糖的單糖組成主要為葡萄糖[28]，通過熱水浸提法提取的靈芝子實體多糖由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖組成，而通過堿抽提法得到的靈芝多糖則為葡聚糖[29]。本研究通過熱水浸提法提取野生靈芝子實體部位的靈芝多糖，結果顯示多糖表征存在一定的差異，各單糖組成和含量同樣存在較大差異。對于靈芝多糖的單糖組成差異較大，部分學者對出現(xiàn)這一差異的原因進行過研究[30-32]，發(fā)現(xiàn)靈芝種類的不同、產地不同、靈芝部位不同以及提取多糖方法的不同，都會導致靈芝多糖在化學結構和組成上有較大的多樣性。

3.3 靈芝多糖的抗氧化活性分析

多糖結構特征包括單糖組成及含量、主鏈結構、分子量大小、糖苷鍵構型等，靈芝多糖化學結構差異很大，對其生物活性具有很大影響，尤其是單糖組成和主鏈結構。大量體外抗氧化試驗證實，從靈芝中分離提取出多糖具有顯著抗氧化活性。本研究提取的3株野生靈芝子實體多糖同樣具有較高的清除自由基能力，在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，相同濃度下，HN-1多糖的抗氧化能力大于HN-3，HN-2最弱，這可能是由于各多糖的單糖組成及含量的差異變化引起，HN-1和HN-3多糖都由三種單糖組成且都含有木糖，HN-2則只由兩種單糖組成。Liao[33]曾研究發(fā)現(xiàn)富含巖藻糖的靈芝多糖具有更好的免疫調節(jié)作用，Ni[34]在分析多糖的單糖組成與活性的相關性分析發(fā)現(xiàn)多糖的抗氧化能力與多糖的單糖組成有著較大相關性關系，其含有木糖的多糖樣品其抗氧化活性明顯較高。還有一些研究表明，多糖的抗氧化能力與多糖的單糖組成、分子量有較大關系[35]。較多單糖組成以及較高含量的木糖可能是決定靈芝子實體多糖具有較高的抗氧化活性的原因之一，本文僅限對于靈芝子實體多糖的單糖組成展開研究，而未對多糖進行純化以及深入研究多糖的具體結構，在今后的試驗中將會更深入研究多糖的詳細結構和多糖發(fā)揮自身抗氧化作用的機制。

4 結論

海南島的野生靈芝特點顯著，可作為靈芝馴化栽培和品種改良的重要材料，采集于海南島的三株野生靈芝子實體多糖的單糖組成及單糖含量具有一定差異，HN-1多糖主要由甘露糖、木糖、鼠李糖組成，其摩爾比為1∶0.29∶0.14，HN-2多糖主要由甘露糖、葡萄糖組成，其摩爾比為1∶1.7，HN-3多糖主要由甘露糖、木糖、葡萄糖組成，其摩爾比1∶1.98∶1.8。另外，三株靈芝的多糖都具有較強的抗氧化能力，其抗氧化能力都隨著多糖質量濃度的增加而提高，HN-1的抗氧化活性最強，其次是HN-3和HN-2的抗氧化活性最弱。通過對海南島野生靈芝資源鑒定、子實體多糖的單糖組成和抗氧化活性研究，為靈芝資源的保護利用以及相關的科學研究提供數(shù)據(jù)參考，為后續(xù)海南島野生靈芝馴化后人工栽培子實體多糖的產品開發(fā)研究奠定實驗基礎。