大棗水提液還原制備納米銀材料及抗氧化和抗菌活性研究

魏思敏，王英輝，唐志書*，蘇 瑞，許洪波，陳 琳，劉世軍，李 琛

1陜西中醫藥大學陜西省中藥資源產業化協同創新中心 秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育)陜西省創新藥物研究中心，咸陽 712083；2長安大學理學院，西安 710064

納米銀材料作為近年來新興的納米材料[1]，因為其既可以克服細菌的耐藥性[2]，又對微生物具有很好的抑制作用、且對正常細胞毒性低[3]，已被廣泛應用于生物醫藥領域，因此研究納米銀材料的制備方法及理化性質具有重要的意義。傳統的制備納米銀材料的方法包括物理法[4]和化學法[5]；其中物理法對大型儀器依賴較強，且會造成高的能量損耗；而化學法中會使用大量的有毒化學試劑，這些特點在一定程度上限制了這兩種制備方法的應用范圍。生物制備法[6]主要利用微生物或植物作為還原劑，是一種環境友好、綠色節能的制備方法，近年來已在納米材料制備領域被逐漸使用[7,8]。

中藥是一類天然的植物資源，關于中藥成分分析的研究表明其含有生物堿[9]、糖類[10]、黃酮類化合物[11]等多種活性成分。前期利用植物作為還原劑制備納米材料的研究顯示：生物堿、糖類和黃酮類等化合物會在制備過程中起到還原劑作用，這一特點為中藥作為還原劑制備納米銀材料提供了先決條件；其次，前期關于植物法制備納米材料的研究表明，植物中的活性成分會進一步吸附在納米材料的表面起穩定作用；因為中藥的生物相容性較好，因此中藥制備得到的納米銀材料更利于其在臨床研究中的應用[12]。

大棗又名紅棗，為鼠李科植物棗(ZizyphusjujubaMill)的干燥成熟果，味甘、性溫，有補脾胃、益氣生精、調和諸藥的功效，還具有補中益氣、緩和藥性、養血安神之功效[13]，在我國已有幾千年的種植史，其藥用價值在《神農本草經》、《本草綱目》、《證類本草》中均有記載。大棗的化學成分中糖類占大棗果肉總干物的80%以上，還原糖占總糖含量的70.8%～95.0%[14]，此外還有蛋白質、生物堿、三萜、皂苷、黃酮和環腺苷酸、環鳥苷酸以及氨基酸等多種活性成分[15]。因此本文首先利用大棗水提液中豐富的化學成分作為還原劑和穩定劑成功制備了納米銀材料，并探討溶液pH、料液比以及反應時間對還原反應效率的影響；隨后通過激光粒度儀以及TEM對所制得納米銀材料的理化性質進行了表征并且探討了可能的還原反應機理；最后對大棗納米銀材料的抗氧化和抗菌活性進行了研究。這些結果不僅可以為納米銀材料的制備提供新的方法，同時也為大棗的綜合開發利用提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2600型紫外可見分光光度計，島津(日本)公司；ZEN 3600激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；JEM-2010型透射電子顯微鏡，東京理化株式會社(日本)；CAP225D電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；Zirbus Vaco 5 凍干機，德國Zirbus有限公司；SHA-B數顯水浴恒溫振蕩器，金壇市雙捷實驗儀器廠；TGL-20B離心機，上海安亭科學儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

硝酸銀(AgNO3，質量分數>99%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、檸檬酸鈉、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂粉均為分析純，購于成都科隆化學品有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)為分析純，購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實驗所用中藥材大棗購于陜西興盛德藥業有限公司，經陜西中醫藥大學劉世軍副教授鑒定為鼠李科植物棗(ZizyphusjujubaMill)的干燥成熟果，符合《中國藥典》2015年版相關規定。供試菌種大腸桿菌(ATCC25922，Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923，Staphylococcusaureus)均由陜西中醫藥大學陜西省中藥資源產業化協同創新中心提供。

1.2 方法

1.2.1 大棗水提液的制備

準確稱取干燥大棗藥材5.0 g(粉碎)，加入100 mL純化水超聲提取4 h，過濾得濾液，備用，經測量大棗水提液的pH為5.0。

1.2.2 不同pH大棗水提液與AgNO3的反應

取5 mL大棗水提液原液一份，另取四份5 mL大棗水提液，用10 mol/L的NaOH水溶液分別調節pH至6.0、7.0、8.0、9.0，向不同pH的大棗水提液中均加入0.01 mol/L的AgNO3溶液5 mL，室溫下超聲反應。因為納米銀在紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)410 nm附近有特征的吸收，所以在合成過程中使用UV-Vis光譜監測納米銀材料的生成。

1.2.3 不同料液比時大棗水提液與AgNO3的反應

確定最佳pH之后，考察不同料液比對于反應的影響，控制大棗水提液與硝酸銀用量比分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5，室溫下超聲反應，過程中通過使用UV-Vis光譜測量410 nm附近吸收峰的強度，確定最佳的料液比。

1.2.4 大棗水提液還原制備納米銀材料

取5 mL大棗水提液，調節pH至優化出來的最適pH，向其中加入0.01 mol/L的AgNO3溶液5 mL，室溫下超聲反應，過程中使用紫外-可見光譜監測410 nm附近吸收峰的變化，待反應完成后取反應懸浮液，9 000 rpm離心30 min，棄上清液取沉淀，用超純水洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥至恒重。

1.2.5 化學還原法制備納米銀材料

取硝酸銀溶于超純水，加入PVP攪拌均勻備用，稱取檸檬酸鈉溶于超純水中，按照檸檬酸鈉-硝酸銀的物質的量比為5∶1，將檸檬酸鈉溶液逐漸滴入硝酸銀溶液中，滴加完畢后加熱回流反應1 h，取懸浮液，9 000 rpm離心30 min，棄上清液取沉淀，用超純水洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥至恒重。

1.2.6 納米銀材料的表征

分別采用UV-2600型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)、ZEN 3600激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)、JEM-2010型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)對納米銀材料進行表征。

1.2.7 納米銀材料抗菌性能研究

1.2.7.1 菌懸液的制備

將測試用的細菌E.coli、S.aureus分別接種于LB固體培養基的培養皿中劃線，37 ℃培養18 h。取滅菌好的試管兩支分別加入LB液體培養基約15 mL，用接種環挑取一環單菌落于試管中，放置于水浴搖床，37 ℃，150 rpm培養18 h。超凈工作臺上，取少許活化的菌體置于培養基試管中，搖勻，制備成1×106CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.7.2 最小抑菌濃度的測定

采用倍比稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)[16]。稱取一定量的大棗納米銀材料、化學法制備的納米銀材料，用無菌水進行配制，使其最終濃度為4 000 μg/mL，隨后依次用無菌水稀釋成系列濃度；將待測的藥液分別加入96孔板上，每孔中加入50 μL的藥液與50 μL制備好的菌懸液，每次都加有無菌水100 μL陰性對照和100 μL菌液作為陽性對照。將96孔板置于37 ℃的培養箱中培養24 h后觀察，以不產生渾濁的孔所對應的最低濃度為該藥液對該菌的最小抑菌濃度。

1.2.7.3 最小殺菌濃度的測定

在得到MIC后，從實驗組的澄清孔中取10 μL培養物，再向其中加入90 μL的LB液體培養基，每個樣品重復3次，放入37 ℃培養箱中培養，每次伴有陰性對照和陽性對照。分別觀察培養 24 h平板上有無菌落生長，無細菌生長的最低濃度為該藥液對該菌的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.8 納米銀材料對DPPH自由基清除能力測定

按照文獻報道的方法[17]，準確稱取2.5 mg DPPH溶解定容于100 mL容量瓶中，于冰箱避光保存。將納米銀材料配制成不同質量濃度梯度的樣品液，精密量取1 mL樣品溶液加入5 mL試管中，再加入1 mL DPPH溶液，將上述反應液置于室溫下暗反應30 min，測定517 nm處的吸光度，每個實驗重復三次。按下列公式計算清除率，并用同等質量濃度的維生素C(VC)溶液作為陽性對照:

自由基清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%

式中A0：1 mL DPPH+1 mL超純水；A1：1 mL DPPH + 1 mL樣品；A2：1 mL樣品+1 mL乙醇。

2 結果與分析

2.1 大棗水提液還原制備納米銀材料

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)是描述金屬的導電電子在電磁場作用下集體振蕩的一個物理概念[18]，這種共振在宏觀上表現為金屬納米粒子對光的吸收；納米銀材料在UV-Vis光譜410 nm附近會出現特征的等離子體共振吸收峰。因為大棗水提液和硝酸銀溶液在410 nm附近沒有明顯的吸收，因此可以通過UV-Vis吸收光譜在410 nm附近的吸收峰來判斷納米銀材料的生成。首先，我們用大棗水提液原液(pH5.0)直接與AgNO3溶液超聲反應1 h，通過UV-Vis光譜測量判斷是否有納米銀生成。如圖1所示，大棗水提液原液與AgNO3反應1 h后UV-Vis光譜在410 nm附近有明顯的吸收峰，表明大棗水提液中的活性成分可以還原AgNO3生成納米銀材料。基于我們前期的研究基礎[19]，提高反應液的pH可以進一步增強水提液中還原性物質的活性，使還原反應更加高效的進行；這主要是因為在堿性條件下，具有還原性的多糖分子以及黃酮類化合物等可能會以負離子形式存在，這種存在形式會使其與Ag+的相互作用增強，從而使還原反應更容易進行，因此我們進行了pH依賴實驗。從圖1可以看出，隨著大棗水提液pH逐漸增大，反應液在410 nm附近的吸光度逐漸升高，更大的吸光度數值表明生成了更多的納米銀材料，這和我們前期的研究結果一致。此外，我們也注意到：(1)當大棗水提液的pH從6.0變化到7.0時其吸光度值的變化最大，這可能是因為大棗水提液中活性成分在此區間內變為負離子形式，這更有利于還原反應的進行，所以使還原反應的效率大大提升；但是當pH大于7.0時，隨著溶液pH值增大，410 nm附近吸光度的變化值逐漸減小，這意味增大大棗水提液pH至7.0后其與AgNO3反應效率降低，因此我們并沒有嘗試在更高pH值(大于9.0)時進行實驗；(2)不同pH值大棗水提液還原得到的納米銀材料等離子體共振峰最大吸收并沒有在同一波長處，根據文獻[20]，納米銀粒徑的不同會導致其在UV-Vis光譜上最大吸收波長不同，這說明大棗水提液的pH不但影響納米銀的生成效率，同時也影響納米銀的粒徑大小。基于以上pH依賴實驗，我們在pH9.0時對還原反應條件進行了進一步的篩選。

圖1 不同pH大棗水提液與硝酸銀反應后混合液的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectra of the mixtures after the reaction between jujube aqueous extract and AgNO3 at different pH

隨后我們在大棗水提液(pH9.0)與硝酸銀溶液的比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶5時進行了反應，考察料液比對還原反應的影響。超聲反應1 h后我們發現：隨著硝酸銀溶液比例增加，UV-Vis光譜上410 nm附近的吸光度值逐漸變小，當兩者比例為1∶1時，410 nm附近的吸光度最大(圖2)，表明在此料液比之下生成的納米銀材料最多；這是因為隨著AgNO3用量增大，Ag+周圍的還原性物質數量減少，反應速率變慢，所以反應相同時間后(1 h)生成納米銀材料的量減少。進一步的，我們嘗試增加反應液中還原性物質的量(大棗水提液∶AgNO3=2∶1)來提高反應效率，但實際上，當料液比為2∶1時，410 nm附近的吸光度值卻相對于1∶1時減少近一半，如圖2所示，這表明在此條件下納米銀材料生成的效率降低。我們推測這主要是因為反應液中還原性物質的含量太多，納米銀材料的成核速度太快，以至于來不及生長為穩定的納米銀粒子所導致，而在UV-Vis光譜上我們只能監測到生長完全且穩定的納米銀，所以當將大棗水提液的用量提高至2∶1，反應相同時間后生成納米銀材料的量反而變少。

圖2 不同料液比反應1 h后混合液的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis spectra of the mixtures after the reaction between jujube aqueous extract and AgNO3 at different ratios

進一步的，我們在pH9.0，大棗水提液和硝酸銀比例為1∶1時，研究了反應時間的影響。我們將0.01 mol/L的AgNO3溶液加入大棗水提液中，分別觀測反應0、1、3、4、6 h后納米銀材料的生成。圖3為反應不同時間后，將反應液稀釋20倍后測得的UV-Vis光譜。從圖中我們發現：在反應0 h時(大棗水提液)，410 nm附近并沒有顯著的吸收；隨著AgNO3溶液加入反應時間增加后，410 nm處出現了明顯的吸收峰，其強度隨著反應時間增加逐漸增加，這說明隨著反應時間的增加體系中生成了更多的納米銀材料；但是當反應進行到4 h后，其反應速率明顯變慢(4和6 h時吸光度值的變化值減小)，這是因為隨反應的不斷進行，大棗水提液中的活性成分被不斷消耗，所以反應速率逐漸減小。反應條件的篩選表明大棗水提液在pH9.0，與AgNO3的料液比為1∶1，反應4 h時效率最高。

圖3 大棗水提液與硝酸銀溶液反應不同時間后反應混合液的UV-Vis吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectra of the mixture after the reaction between jujube aqueous extract and AgNO3 at different times

2.2 透射電鏡(TEM)表征納米銀材料的形貌

我們使用TEM對在反應效率最高條件下制備的納米銀材料形貌進行了表征。具體步驟如下：將制備得到的大棗納米銀材料懸浮液稀釋3倍，滴加一滴在銅網附有碳膜支持的一面，銅網自然晾干3 h后，利用TEM對其形貌進行表征。結果如圖4(a)所示，從圖中可以看出，我們制備得到的納米銀材料呈近球形，分散較均勻、粒徑大部分分布在20～30 nm之間；這與我們通過化學制備法得到的納米銀形貌基本類似(圖4(b))，粒徑也相當。

2.3 大棗納米銀材料的平均粒徑及zeta電位

取1 mL大棗納米銀材料溶液置于激光粒度儀的測試皿中，測試溫度25 ℃，測量三次。我們分別測量了不同pH值以及料液比時納米銀材料的粒徑，結果如圖5所示。可以看出：隨著反應液pH逐漸升高，納米銀的平均粒徑從130 nm左右減小到30 nm左右；這主要是因為當大棗水提液在較大pH時，大棗水提液中具有還原性的活性成分大多處于負離子的形式，這種存在形式有利于其與Ag+的相互作用，并導致還原反應速率加快，納米銀的成核速度大于生長速度，因此在較大pH時生成的納米銀粒徑變小。同時，我們也考察了不同料液比對納米銀材料粒徑的影響，結果如圖5所示。從圖4可以看出：隨著硝酸銀比例增大，反應生成的納米銀材料粒徑逐漸增大，這主要是因為在Ag+周圍具有還原性的活性成分含量減少，所以還原反應的速率將會變慢，使得納米銀的成核速度小于生長速度，所以納米銀顆粒會不斷生長形成粒徑更大的材料。最后，我們也對在反應液pH9.0，料液比為1∶1，反應時間為4 h時制得的納米銀材料平均粒徑和zeta電位進行了測量，其中平均粒徑為25.99 ± 1.3 nm，和我們通過TEM得到的結果完全一致；zeta電位為-29.6 mV(圖5)，說明納米銀材料表面吸附了帶有負電荷的化合物，這進一步證實了我們上文推測的在反應液pH為堿性時，大棗水提液中參與還原反應的活性物質可能是以負離子形式存在的結果一致。正是由于這些負電荷之間的靜電排斥作用使得我們制備得到的納米銀材料不發生團聚，具有較高的穩定性。

圖4 (a)大棗水提液；(b)化學法還原AgNO3制備得到納米銀材料的TEM圖像Fig.4 TEM image of the synthesized AgNPs by (a) jujube aqueous extract;(b) citrate sodium

2.4 納米銀材料對DPPH自由基的清除能力

接著我們對所制得的納米銀材料對于DPPH自由基的清除能力進行了評價。由圖7可以看出：大棗納米銀材料對DPPH有清除作用，并且清除率隨著大棗納米銀材料濃度增大顯著增加，在0～200 μg/mL范圍內呈一定量效關系；當大棗納米銀材料的濃度達到100 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率可以達到83%，這說明制得的納米銀材料具有較強的自由基清除能力；但是當納米銀材料的濃度大于100 μg/mL后，清除率隨濃度的變化增加緩慢。

圖5 不同條件下納米銀材料的粒徑Fig.5 Size distribution of AgNPs at different conditions

圖6 納米銀材料的粒徑和zeta電位Fig.6 The zeta potential and size of synthesized AgNPs

2.5 大棗納米銀材料的抑菌活性實驗

隨后，我們進行了抗菌實驗，發現：大棗水提液制備得到的納米銀材料相比化學方法制備的納米銀材料(制備方法詳見“1.2.5”，表征數據見“2.2”)，抗菌活性大大提高，大棗納米銀材料對大腸埃希菌的最小抑菌濃度(MIC)為100 μg/mL，對比化學方法制備的納米銀材料(500 μg/mL)活性增加了5倍。大棗納米銀材料對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為125 μg/mL，相比于化學方法制備的納米銀材料(500 μg/mL)其活性增加了4倍，詳見表1。大棗水提液還原法制備的納米銀材料對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均有很強的抑制作用，優于化學方法制備的納米銀材料和大棗水提液單獨使用時的效果。根據文獻報道，中藥制備的納米銀材料表面會吸附中藥的活性成分，因此我們推測納米銀材料表面吸附的大棗水提液活性成分，使得該方法制備的納米銀材料比化學方法有更好的抗菌活性。此外，有文獻報道[21]：納米銀材料與細菌細胞膜接觸進入細菌細胞后，在光的催化作用下會與細菌細胞中的水或者氧反應生成活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)，產生的活性氧物種既會與細菌的DNA發生反應，干擾細菌DNA的轉錄和復制過程，也會與細菌的蛋白質作用使其變性，最終導致細菌死亡從而產生抗菌效果。利用大棗水提液制備得到的納米銀材料其表面可能被還原性多糖分子所覆蓋，這導致其更容易通過細胞膜進入細胞內部，使細菌細胞內的大棗納米銀材料數量多于化學法制備的納米銀材料，更多的納米銀材料會產生更多的活性氧物種，最終會導致更多的細菌細胞死亡，進一步增強納米銀材料的抗菌活性，因此使用大棗水提液還原法制備的納米銀材料其抑菌效果更為明顯。

圖7 大棗納米銀材料對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Free radical scavenging assays of AgNPs against DPPH

表1 不同方法制備的納米銀材料及大棗水提液的抑菌活性

注：“-”表示待測中藥液的MIC>10 mg/mL。

Note： “-” represents the MIC value of jujube aqueous extract is greater than 10 mg/mL。

2.6 納米銀材料的形成機理

根據文獻報道[22]，植物還原法制備納米材料過程中還原性糖類化合物可能起到重要作用。大棗中含有大量還原性多糖，因此我們推測在反應過程中，還原性多糖作為主要的活性成分參與還原反應。具體過程可能為：還原性多糖分子中所含有的還原性醛基作為還原劑，經過反應之后自身會被氧化成羧基(圖8所示)；此外，由于糖類分子上有著大量的極性羥基和醚氧基團，在堿性條件下，糖類化合物中羥基更容易失去質子帶有負電荷，帶有負電荷的氧原子能通過靜電相互作用將與帶正電荷的Ag+束縛在其周圍，較短的距離更利于還原反應的進行，因此還原速率增大，這可以從我們的pH依賴實驗得到證實。同時這些靜電相互作用還能夠降低Ag+的活動性，較快的反應速率使納米銀材料的成核速度大于生長速度(如果生長速度較快容易造成納米銀粒子團聚)，能阻止納米銀材料生長為粒徑更大的材料；我們使用大棗水提液在最佳反應條件時制備得到的納米銀材料粒徑很小，主要分布在20～30 nm，這從一定層面能證實我們的推測。最后，帶有負電性的多糖分子會吸附在納米銀材料的表面，因為帶有負電性的羥基之間會產生靜電排斥作用，防止了納米銀材料之間發生團聚作用形成粒徑更大的納米銀材料甚至于聚沉。

圖8 納米銀材料形成的可能機制Fig.8 The proposed mechanism for formation of silver nanoparticles

3 結論

本研究以大棗水提液作為還原劑，利用超聲法在室溫下成功制備了納米銀材料，通過對反應條件(溶液pH、料液比和反應時間)的篩選，得到了最佳反應條件(pH9.0，料液比1∶1，反應時間4 h)。進一步的理化性質表征發現：(1)反應液的pH和料液比對納米銀材料的粒徑具有較大的影響；(2)在最佳反應條件時制得的納米銀呈近球形、分散較均勻，平均粒徑為25.99±1.3 nm；(3)納米銀材料表面帶負電性，還原反應機理的初步探討顯示可能是還原性多糖等活性物質以負離子的形式吸附在納米銀表面使其帶有負電荷，最終起到穩定納米銀的作用。最后，生物活性研究顯示：利用大棗水提液還原法制得的納米銀材料對DPPH自由基具有很高的清除率(83%)；同時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為100和125 μg/mL，為傳統化學法制得的納米銀材料的5倍和4倍。我們的這些結果不僅為納米銀材料的制備提供了新的方法，也為大棗資源的開發利用提供了新的思路。