豫西黑豬線粒體COXI基因的擴增和系統發生分析

周武 楊又兵 王陽陽 王麗 徐碩輝 邢沛 和俊豪 卞軍平 龐有志

摘要? ? 豫西黑豬作為一個極具發展潛力的地方品種，其種質資源面臨著基因混雜的風險。通過對豫西黑豬的線粒體COXI基因進行PCR擴增、測序，并與其他22種不同豬種的COXI基因進行序列比對，采用最大似然法（ML法）和鄰接法（NJ法）建立系統發育樹，探究其與其他豬種之間的遺傳變異及種系發育關系。結果表明，23個豬種該基因序列保守位點和變異位點分別占總位點的96.5%和3.5%，不同豬種間線粒體COXI基因的相似度均在96.5%以上。豫西黑豬線粒體COXI基因表現出明顯A、T堿基偏好性。系統發育樹和遺傳距離結果顯示，豫西黑豬種內遺傳距離較近，并且與杜洛克豬的遺傳距離較近，說明豫西黑豬與杜洛克豬之間存在基因混雜情況。

關鍵詞? ? 豫西黑豬;線粒體;COXI基因;NJ樹;ML樹

中圖分類號? ? S828.8+9? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）07-0211-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

豫西黑豬是河南西部地區的一個重要且極具發展潛力的特色豬種，具有肉質鮮美、風味獨特、抗應激、耐粗飼等優良特性[1]，但由于外來洋豬種的不斷引進、實際生產過程中操作不規范、防疫水平低等原因，致使黑豬的優良特性發揮極不充分，瀕臨滅絕，其保種復壯工作的開展刻不容緩。

線粒體是一種獨立且存在于細胞核之外的有雙層膜結構的細胞器，其內部擁有不同于細胞核遺傳物質的信息量，而且其形態結構較穩定，常被用作分子標記，為生物的遺傳、進化、疾病治療等研究提供了大量分子學依據[2]。COXI基因則是線粒體DNA的重要組成部分，它具有進化速度快、結構穩定、母系遺傳等特點，常被作為分子標記來比較生物體種內或種間進化變異的相互關系，現在寄生蟲、靈長類動物的分子進化規律及血緣關系的系統發育的研究中大量應用此技術[3]，但目前基于COXI基因對于豫西黑豬的研究還較少。

本研究通過對豫西黑豬的線粒體COXI基因進行PCR擴增、測序，并與其他22個不同豬種的COXI基因進行序列比對，采用MEGA 7.0軟件應用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建立系統發育樹，探究豫西黑豬與其他不同豬種之間的遺傳變異關系，以期為豫西黑豬種質資源的保護提供科學有效的理論依據與數據支撐。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

本研究采集豫西黑豬和商品白豬血液樣本各15個，血液樣本的采集方法是前腔靜脈采血[4]。

1.2? ? 豫西黑豬線粒體DNA COXI基因引物合成

其他豬種的COXI基因序列來自NCBI數據庫中Gen Bank，利用Premier 5.0軟件對豫西黑豬的COXI基因進行引物設計[5]，上游引物F的序列為5-ACTACTTCCACCATCCT

T-3;下游引物R的序列為5-CCTATAATGGCGAACACT-3，退火溫度為48 ℃，引物基因擴增長度為864 bp，該基因的合成工作由上海生工公司完成。

1.3? ? PCR擴增技術

利用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，擴增CO-XI基因的DNA片段，PCR反應體系（20 μL）為：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.7 μL，DNA模板1 μL，加入ddH2O至終體積20 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察擴增條帶。

1.4? ? 統計分析

將檢驗合格的PCR產物做好標記及編號，送至上海生工公司進行序列雙向測定。將測序結果導入Chromas軟件中對測序結果峰值進行人工校對，之后利用DNA MAN 9.0軟件對雙向測序結果進行拼接，拼接出目的基因COXI基因序列，將序列拼接結果按“fasta”保存于記事本中。從NCBI數據庫中尋找其他豬種的COXI基因，按相同“fasta”格式將其保存于記事本中[6]，利用MEGA 7.0軟件，將豫西黑豬線粒體COXI基因與其他豬種相應基因進行剪切、比對，分析堿基組成及變異情況，觀察豫西黑豬與其他豬種間的遺傳距離。

2? ? 結果與分析

2.1? ? COXI基因序列擴增及測序結果

2.1.1? ? COXI基因擴增產物結果分析。將電泳產物放在凝膠成像系統及紫外線燈照射下，可以見到1條清晰可見的明亮條帶[7]，條帶居于長度750～1 000 bp之間且基本處于中間位置，故可基本確定擴增產物的目標長度為864 bp，與預期基本相符。詳細擴增產物電泳分析見圖1。

2.1.2? ? COXI基因擴增產物測序結果分析。通過對豫西黑豬的線粒體COXI基因進行測序，結果顯示，堿基之間無重疊，結果較為清晰，說明COXI基因擴增、測序結果均符合預期，可以進行后續的序列比對分析。

2.2? ? 豫西黑豬與其他不同豬種的COXI基因序列比對分析

將豫西黑豬線粒體COXI基因雙向測序的結果導入DN

AMAN 9.0軟件比對拼接，確定13個送檢樣品的COXI基因序列結果。同時，利用NCBI軟件Gene Bank數據庫下載的其他28種豬的線粒體COXI基因序列[8]。運用MEGA 7.0軟件對比送測的13個豫西黑豬樣本的線粒體COXI序列，從中找出具有遺傳穩定性的序列3個，并將送測的3個商品白豬中具有遺傳穩定性的序列挑出。將選出的豫西黑豬、商品白豬及挑選出的21個其他不同豬種的線粒體COXI基因導入MEGA 7.0軟件進行序列比對，將序列兩端不準確及序列長度不同的序列進行裁剪，剩下序列長度為832 bp。經過比對，不同豬種間線粒體COXI基因的相似度均在96.5%以上。通過計算得出豫西黑豬線粒體COXI基因各堿基的平均含量比例分別為A 27.4%、T 31.9%、C 24.5%、G 16.2%，A+T的平均含量為59.3%，遠高于C+G的平均含量40.7%，表現出A、T堿基偏好性。同時，相較于其他3種堿基，G堿基的含量最少，表現出明顯的非G堿基偏好性，這種非G偏愛（Ant

i-Ghias）的特性是后生動物線粒體基因組L-鏈堿基組成所獨有的特點[9]。從序列角度看，12條豫西黑豬線粒體COXI序列中有10條基本相同，而剩余的2條堿基存在一定的差異，從10條不變基因中拿出1條與另外2條相比，存在8個變異位點。該現象說明，豫西黑豬種內COXI基因存在差異性，證明豫西黑豬種間存在變異情況。

2.3? ? 不同豬種間線粒體COXI基因系統發育分析

在數據庫中找到民豬、大白豬、杜洛克豬等其他22個不同豬種的線粒體COXI基因序列。將豫西黑豬以及其他22個不同豬種的線粒體COXI基因導入MEGA 7.0軟件中，采用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）基于COXI序列建立系統發育樹，其中NJ法是基于遺傳距離所建立的方法，不構建聚類，直接為內部節點計算距離，運算速度最快;而最大似然法是基于特征的構建方法，自動檢索多次，可信度高[10]。構樹成功后，據生成系統發育樹的圖像顯示，此25個不同樣本根據遺傳距離的遠近及親緣性可以分為3個部分，其中豫西黑豬樣本中的1號、5號、16號遺傳距離較近，發生聚集;大白、長白、杜洛克等國外商品豬豬種遺傳距離較近，發生聚集;而榮昌豬、姜曲海豬等我國地方品種遺傳距離相對較近，發生聚集。同時，根據系統發育樹的分支情況以及遺傳距離顯示，豫西黑豬與國內其他豬種的遺傳距離大于豫西黑豬與杜洛克等國外商品豬種遺傳距離。因此，基本可以證明豫西黑豬樣本基因已經發生混雜，故可推測豫西黑豬可能存在與杜洛克國外商品豬雜交等情況。系統發育樹構建情況詳見圖2、3。

3? ?結論

本文對豫西黑豬線粒體COXI基因進行擴增，擴增長度為864 bp，并對擴增片段進行測序，與其他22個不同豬種進行序列比對及構建系統發育樹。結果表明，豫西黑豬與其他豬種的COXI基因具有高度一致性，同時存在大量變異位點，豫西黑豬種內存在變異位點8個，說明豫西黑豬存在種內變異;豫西黑豬與國外商品豬種存在變異位點24個，變異位點多;豫西黑豬與其他地方豬種存在變異位點17個，說明豫西黑豬與其他豬種間存在明顯差異，并存在與其他豬種基因混雜的可能。通過利用鄰接法和最大似然法建立的系統發育樹可知，兩樹代表的分類意義基本一致，系統發生樹基本可分為3支，國外商品豬種遺傳距離較近分為一支，豫西黑豬樣本分為一支，但豫西黑豬種內存在分支，其他地方豬種分為一支，從系統發生樹情況基本得知，豫西黑豬樣本與杜洛克等國外商品豬種基因混雜的可能性最大。該試驗可為豫西黑豬保種復壯工作提供數據支撐，為豫西黑豬種質基因提純工作提供了方向，并為其種質資源保護提供科學參考。

4? ? 參考文獻

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