復方浙貝浸膏聯合奧沙利鉑對人結腸癌耐奧沙利鉑移植瘤及細胞膜耐藥相關蛋白表達的影響

呂鵬 趙歡 石鳳芹 陳信義 侯麗

摘要：目的? 觀察復方浙貝浸膏（CZBE）聯合奧沙利鉑（L-OHP）對人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT116/L-OHP移植瘤小鼠的抑瘤作用，以及對移植瘤細胞耐藥相關蛋白MDR1、MRP1及LRP5表達的影響。方法? 將人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT116/L-OHP細胞接種于Balb/C裸鼠右前腋皮下構建人結腸癌耐L-OHP移植瘤模型，成模后按隨機數字表法將移植瘤小鼠分成模型組、L-OHP組（L-OHP 3 mg/kg）、CZBE高劑量（CZBE 10 g/kg）聯合L-OHP組、CZBE中劑量（CZBE 5 g/kg）聯合L-OHP組、CZBE低劑量（CZBE 2.5 g/kg）聯合L-OHP組。分組當日開始給藥，CZBE灌胃給藥，每日1次;L-OHP腹腔注射，隔日1次。連續給藥2周。實驗結束后處死小鼠，稱重后完整剝離瘤體并稱瘤質量，計算腫瘤抑制率。將瘤塊組織制成切片，免疫組化檢測HCT116/L-OHP移植瘤細胞膜耐藥相關蛋白表達。結果? 各劑量CZBE聯合L-OHP均可有效抑制HCT116/L-OHP裸鼠移植瘤的增長。L-OHP組腫瘤抑制率為27.239%，CZBE高劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為45.031%，與L-OHP組比較差異有統計學意義（P<0.05），CZBE中劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為37.669%，CZBE低劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為32.147%。與模型組比較，L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5的IOD/Area值差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組及L-OHP組比較，各劑量CZBE聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達量均不同程度降低，其中，CZBE中、高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1蛋白表達量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），CZBE高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞LRP5蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? CZBE聯合L-OHP可提高人結腸癌耐L-OHP細胞株移植瘤的腫瘤抑制率，其機制可能是通過減少人結腸癌耐L-OHP細胞膜耐藥相關蛋白表達，增加結腸癌細胞對化療藥物的敏感性，從而起到協同增效作用。

關鍵詞：復發浙貝浸膏;結腸癌;細胞增殖;多藥耐藥

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0043-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907434

Effects of Compound Zhebei Extract Combined with Oxaliplatin on Oxaliplatin-resistant Human Colon Cancer Cells and the Expression of Drug Resistance-related Proteins

LYU Peng， ZHAO Huan， SHI Fengqin， CHEN Xinyi， HOU Li

Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

Abstract： Objective To observe the anti-tumor effect of compound Zhebei Extract （CZBE） combined with oxaliplatin （L-OHP） on human colon cancer cell line HCT116/L-OHP transplanted tumor in mice， and its effects on the expressions of MDR1， MRP1 and LRP5 in transplanted tumor cells. Methods Human colon cancer L-OHP-resistant transplanted tumor model was established by inoculating human colon cancer Oxaliplatin-resistant cells （HCT116/L-OHP） under the right anterior axillary skin of Balb/C nude mice. After the successful establishment of the model， the transplanted mice were divided into five groups according to random number table method： model group， L-OHP group （3 mg/kg L-OHP）， CZBE high-dosage （10 g/kg） combined with L-OHP group， CZBE medium-dosage （5 g/kg） combined with L-OHP group， CZBE low-dosage （2.5 g/kg） combined with L-OHP group. Medication was conducted once the groups were divided. CZBE was given through gavage， once a day; L-OHP was?injected intraperitoneally once every other day for 2 weeks. At the end of the experiment， mice were executed， weighed， and the tumors were removed completely， and the tumor inhibition rate was calculated. Tumor tissue was sliced. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of drug resistance-related proteins in HCT116/L-OHP transplanted tumor cells. Results CZBE combined with L-OHP could effectively inhibit the growth of HCT116/L-OHP xenografts in nude mice. The tumor inhibition rate of L-OHP group was 27.239%， and that of CZBE high-dosage combined with L-OHP group was 45.031%， which was significantly different from L-OHP group （P<0.05）. The tumor inhibition rate of CZBE medium-dosage combined with L-OHP group was 37.669%， that of CZBE low-dosage combined with L-OHP group was 32.147%. Compared with the model group， there was no statistical significance in the IOD/Area values of MDR1， MRP1 and LRP5 in L-OHP group （P>0.05）. Compared with model group and L-OHP group， the IOD/Area values of MDR1， MRP1 and LRP5 of transplanted tumor cells in each dosage combination group decreased in varying degrees. The IOD/Area values of MDR1 and MRP1 in the medium- and high-dosage combination groups decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）， while the IOD/Area values of LRP5 in the high-dosage combination group decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion CZBE combined with L-OHP can improve the tumor inhibition rate of transplanted human colon cancer L-OHP resistant cell lines. The mechanism may achieve synergistic effect by reducing the expression of L-OHP cell membrane resistance-related proteins in human colon cancer and increasing the sensitivity of colon cancer cells to chemotherapeutic medicine.

Keywords： Compound Zhebei Extract; colon cancer; cell proliferation; multidrug resistance

結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，就診時多數已屬中晚期，死亡率較高[1-2]。晚期結直腸癌術前同步放化療、新輔助放化療及術后輔助化療中加用奧沙利鉑可以提高局部緩解率，但由于對奧沙利鉑耐藥等因素，遠期預后改善有限[2-3]。中醫藥在晚期結直腸癌圍化療期中具有協同增效、逆轉多藥耐藥的獨特優勢[4]。復方浙貝浸膏（CZBE）是北京中醫藥大學東直門醫院血液腫瘤科根據晚期惡性腫瘤臨床特點組方，由浙貝母、川芎、漢防己（1∶1∶1）3味中藥組成，方中浙貝母化痰散結，川芎行氣活血化瘀，漢防己利濕消腫以截生痰之源。課題組前期體外細胞實驗顯示，復方浙貝藥物血清高、中、低劑量組對HCT-116細胞增殖抑制率分別為40.00%、42.37%和29.15%，細胞凋亡率分別為18.75%、20.00%、15.32%，均高于對照組（P<0.05），能通過調節P53通路抑制HCT-116細胞增殖、促其凋亡[5]。但CZBE對結直腸癌體內抗腫瘤機制研究尚未開展。本實驗研究通過構建人結腸癌耐奧沙利鉑小鼠移植瘤模型，從體內觀察CZBE對耐奧沙利鉑結直腸癌細胞的抑制作用及細胞膜耐藥相關蛋白表達的影響，進一步豐富CZBE對結腸癌的療效及作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 藥物

CZBE，棕褐色粉末，藥物密封，避光陰涼處保存，水溶解性好，北京中醫藥大學東直門醫院中藥房提供，批號17102504P，實驗前用雙蒸水配成混懸液，冰箱冷藏避光保存。注射用奧沙利鉑，凍干型，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，規格100 mg/瓶，類白色疏松狀粉末，批號170809AG。用無菌5%葡萄糖注射液稀釋至使用濃度。

1.2? 細胞株及動物

人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT116/L-OHP，中國中醫科學院常規保存。雄性Balb/C裸鼠，15～17 g，SPF級，斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，動物許可證號SYXK（京）2014-0003，實驗全過程在具屏障系統動物飼養室內完成，動物飼養室實驗設施合格證號SYXK（京）2002-0016。飼養室溫20～25 ℃、日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～60%，光照12 h明暗交替，空氣潔凈度為100級，氨濃度≤14 mg/m3，噪聲≤60 db，工作照度為150～300 L，動物照度為100～200 Lx。鼠食用滅菌鼠飼料，北京科澳協力飼料有限公司。小鼠自由飲用過濾消毒水。

1.3? 主要試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液，華潤雙鶴藥業股份有限公司，批號F201611075;無水乙醇（分析純），北京北化精細化學品有限責任公司，批號20170727;5%葡萄糖注射液，華潤雙鶴藥液股份有限公司，批號F201812112。HRP-山羊抗小鼠（Servicebio，貨號GB23301）。醫用凈化工作臺，CJ-2F型，凈化等級100級（美國聯邦標準209E），蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司，librorEB-280型分析天平;82-1型電動離心機，奧豪斯電子精密天平，量程0.01～510 g，美國OHAUS Corp;日本NIKON倒置顯微鏡、Olympus/PM-6顯微鏡;電子數顯卡尺，桂林廣陸數字測控股份有限公司，型號SF2000，分辨率0.01 mm，規格0～150 mm，標準GB/T14899-94;病理切片機，上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016;烤片機，天津天利航空機電有限公司，型號KPJ-1A/11030574;攤片機，浙江金華科迪儀器設備有限公司，型號KD-P。

2? 實驗方法

2.1? 造模

①細胞培養：HCT116/L-OHP細胞用10%胎牛血清、1%雙抗RPMI1640完全培養基，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，2～3 d換液1次。②接種：收集對數生長期細胞，1000 r/min離心5 min，無血清RPMI1640培養液稀成濃度為6×107個/mL細胞懸液，每只鼠右前腋皮下接種6×106個細胞，即0.1 mL細胞懸液。

2.2? 分組和給藥

成瘤后，將移植瘤裸鼠隨機分為5組，即模型組、L-OHP組（3 mg/kg L-OHP腹腔注射，隔日1次）、CZBE高劑量聯合L-OHP組（CZBE 10 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次）、CZBE中劑量聯合L-OHP組（CZBE 5 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次）、CZBE低劑量聯合L-OHP組（CZBE 2.5 g/kg灌胃，每日1次;L-OHP 3 mg/kg腹腔注射，隔日1次），每組10只。連續給藥2周。實驗開始后每3 d用卡尺測皮下瘤長徑和短徑。

2.3? 瘤質量及腫瘤抑制率

末次給藥后約6 h，頸椎脫臼法處死小鼠，稱體質量后完整剝離小鼠移植瘤組織，測量各組小鼠腫瘤體積并稱重，根據瘤質量計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=[1-（實驗組瘤質量÷模型組瘤質量）]×100%。

2.4? 多藥耐藥相關酶檢測

免疫組化檢測各實驗組移植瘤組織細胞MDR1、MRP1、LRP5表達，步驟：①將各實驗組瘤塊組織進行石蠟包埋，脫蠟脫水，采用免疫組化SP二步法（嚴格按試劑盒說明書操作），抗原熱修復3 min，切片浸入0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加3%H2O2，10～15 min，0.01mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加一抗，37 ℃濕盒孵育90 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加二抗（生物素標記辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG抗體），37 ℃濕盒孵育90 min。0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，DBA顯色劑顯色15 min，自來水沖洗，蘇木精復染，中性樹膠封固，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照;②TopⅡ和GST判定標準：TopⅡ及GST染色陽性物質主要定位于細胞漿及細胞核，呈棕黃色顆粒為陽性細胞，應用Image ProlPus 7.0免疫組化彩色圖像分析系統對免疫組化染色結果進行定量分析，以對照組陽性點為基礎，對視野統一測定參數，分析實驗各組圖片陽性點積分光密度與細胞分布區域面積之比（IOD/Area）反映免疫組化圖片中目標蛋白平均表達量。

3? 統計學方法

采用SPSS21.0和Grapad Prism 7.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，均數間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 實驗動物瘤質量及腫瘤抑制率比較

實驗過程中各組小鼠皮下移植瘤持續增長，其中模型組小鼠瘤體積生長最快，其他依次為L-OHP組、CZBE低劑量聯合L-OHP組、CZBE中劑量聯合L-OHP組、CZBE高劑量聯合L-OHP組。CZBE聯合L-OHP對人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株具有顯著抑制作用。CZBE高劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為45.03%，與陽性藥L-OHP組比較差異顯著（P<0.05），CZBE中劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為37.67%，CZBE低劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為32.15%，L-OHP組腫瘤抑制率為27.24%，見表1。

4.2? 免疫組織化檢測結果

標記的MDR1、MRP1、LRP5呈棕黃色，主要存在于細胞漿及細胞膜中。顯微鏡放大400倍顯示，模型組及L-OHP組可見較多的MDR1、MRP1、LRP5表達細胞，差異均無統計學意義（P>0.05）。CZBE各劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5表達減少;其中，與模型組及L-OHP組比較，CZBE中、高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），CZBE高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞LRP5表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖1～圖3。

4.3? 復方浙貝浸膏聯合奧沙利鉑對移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達的影響

與模型組比較，L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組、L-OHP組比較，CZBE各劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達降低，CZBE中、高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1蛋白表達差異有統計學意義（P<0.05），CZBE高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞LRP5蛋白表達差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

5? 討論

多藥耐藥性是指腫瘤細胞對一種化學治療藥物產生耐藥后，對未經接觸的、結構和功能各異的多種抗腫瘤藥物也產生交叉耐藥的現象，是目前阻礙化學治療實施、影響聯合化學治療效果的一大障礙。多藥耐藥相關蛋白（MRP）家族由MRP1～MRP9共9個成員組成，可通過細胞膜轉運多種抗腫瘤藥物，從而限制腫瘤藥物進入細胞發揮抗腫瘤作用。在結腸癌組織中，其表達與MDR1、LRP5表達呈顯著正相關，MDR1、MRP1、LRP5的高表達是結腸癌臨床緩解率低、轉移風險增加的獨立危險因素，降低MDR1、MRP1、LRP5的表達逆轉結腸癌多藥耐藥[6-8]。

中醫藥在晚期惡性腫瘤的多學科綜合治療模式中具有增效減毒的獨特優勢，腫瘤積聚及多藥耐藥的難治特點符合中醫“頑痰”反復難治的特征[9]，《靈樞·百病始生》“凝血蘊裹而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣”奠定了血瘀津停、痰瘀互結腫瘤病機的基礎。痰瘀作為臨床常見的致病因素和病理產物，與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關，化痰祛瘀法為中醫防治腫瘤復發轉移的常用治療法則[10-12]。CZBE方中浙貝母化痰散結，川芎行氣活血化瘀，漢防己利濕消腫以截生痰之源，共奏活血化痰散結之效。課題組前期體外細胞實驗顯示，CZBE能抑制人結腸癌HCT-116細胞增殖、促其凋亡[5]。

本研究通過體內實驗究表明，CZBE各劑量聯合L-OHP均能有效抑制HCT116/L-OHP裸鼠移植瘤體積的增長。CZBE高劑量聯合L-OHP組腫瘤抑制率為45.031%，與L-OHP組比較差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組、L-OHP組比較，CZBE各劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1、LRP5蛋白表達均降低，CZBE中、高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞MDR1、MRP1差異有統計學意義（P<0.05），CZBE高劑量聯合L-OHP組移植瘤細胞LRP5差異有統計學意義（P<0.05）。本研究表明，CZBE聯合L-OHP能有效抑制人耐奧沙利鉑結腸癌細胞株裸鼠移植瘤的增長，提高抑瘤率，其機制可能是通過減少移植瘤細胞膜耐藥相關蛋白MDR1、MRP1、LRP5的表達，逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性，起到協同增效作用。結合課題組前期體外細胞實驗，本研究從移植瘤裸鼠體內實驗證實CZBE對于人耐奧沙利鉑結腸癌的療效及作用機制。

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（收稿日期：2019-07-28）

（修回日期：2019-08-18;編輯：華強）

基金項目：北京市科技計劃“十病十藥”研發專項（Z151100003815027）

通訊作者：侯麗，E-mail：houli1203@126.com