點擊化學反應在食品分析檢測中的研究進展

關樺楠，劉博，張娜，龔德狀，宋巖，劉曉飛

(哈爾濱商業大學 食品工程學院，哈爾濱 150076)

1 概述

點擊化學(click chemistry)反應是由美國化學家諾貝爾化學獎獲得者Sharpless在2001年提出的概念[1]。點擊化學反應可像“點擊鼠標”一樣形象地描述其化學反應過程，即在嚴格控制技術要求的條件下細致地操作高活性的反應物[2]，將分子片段可控地連接的一系列技術。也可通過某一化學物質的刺激，產生一系列可靠的化學反應，構建出一種新的化學基團的方法。點擊化學中反應合成多樣性的化合物是利用少數經典的反應通過有效化和模塊化的途徑。目前，在許多研究領域點擊化學反應技術的應用得到迅速發展，并在表面改性、有機合成、生物分子研發和納米顆粒制備等方面有著很廣泛的應用[3-6]。近些年來，由于點擊反應具備反應條件溫和、原料易得、選擇性好、產物收率高、易于分離提純和特異性強等特點，使其被應用到食品分析檢測的相關研究中。本文針對點擊反應的特點和類型，綜述其在食品領域中的研究進展，分析其現存的問題缺陷，并展望點擊化學技術在該領域的應用前景。

2 點擊反應的概述

2.1 點擊反應的特點

點擊化學的反應過程一般有以下幾個特點[7]：反應的條件簡單，例如在反應過程中對氧氣和水不敏感；起始原料和反應物易得；不需要溶劑或者溶劑易去除；產物簡單易于分離；所生成的產物在生理條件下穩定。點擊反應中最常使用的兩種溶劑是去離子水和雙蒸水，其中主要原因是有機分子在不能充分溶解時，在水中的自由能反而會更高，也使其比在水溶劑中有更高的表觀速率常數，能夠得到單一的較高產率的產物。其次，在一些反應中，反應物間的反應速度反而比水更快，如Schotten-Baumann反應中酰氨是由酰鹵和氨水生成的[8]；再者，在水溶液中也可以消除質子性官能團對反應的干擾。因此，點擊反應就不需要保護基團且對環境友好。綜上所述，點擊化學反應的低成本、選擇性好和溶劑易選擇等因素，決定其可以應用于食品分析檢測等領域。

2.2 點擊反應類型

現階段，點擊化學主要有4種類型[9]，即端炔基與疊氮的環加成反應、環炔基與疊氮的環加成反應、巰基與碳碳多鍵的加成反應和非醇醛羰基化合物的縮合反應。以上所述4種典型的點擊化學反應配位構建示意圖見圖1[10]。

圖1 常用的典型點擊反應示例Fig.1 Common examples of typical click reactions

注：a表示Cu(I)-催化的炔和疊氮化物的環加成反應；b表示炔和疊氮化物的環加成反應；c表示非醇醛羰基化合物的縮合反應；d表示硫醇烯加成反應。

2.2.1 端炔基與疊氮的環加成反應

在現階段，端炔基與疊氮的環加成反應是研究的較多且應用廣泛的一種典型的點擊化學反應，也叫Huisgen 環加成反應[11]，其反應原理見圖1中a。該反應最初的反應條件是需要在較高的壓力或溫度下，且會得到混合的產物，即順式和反式三唑環的混合物，然而，在通過Cu(I)催化下，其反應速率可以提高約106倍，且幾乎可以定量地通過1,4-二取代選擇性地生成1,2,3-三唑環化合物[12]，其反應機理見圖2[13]。此類反應的反應條件可以在非質子溶劑或多種質子溶劑中進行，并且不受其他官能團的影響，在反應過程中使用Cu(I)作為催化劑，可以直接添加、或是在反應過程中通過Cu(Ⅱ)的還原、或者由Cu(0)氧化得到。因此，如果在反應過程中直接使用Cu(I)作為催化劑，為了防止Cu(I)被氧化，反應需要在無氧條件下進行。然而，現在也有一些研究表明在有氧條件下環加成反應同樣可以進行[14,15]，例如：可以添加一些還原性的物質在反應體系中(例如檸檬酸、抗壞血酸鈉等)，或者原位還原使Cu(Ⅱ)還原成Cu(I)使其參與反應。

圖2 端炔基與疊氮的環加成反應原理Fig.2 Principle of cyclic addition reaction of acetylene with azide

2.2.2 環炔基與疊氮的環加成反應

端炔基與疊氮的環加成反應是利用銅鹽作為催化劑，因此很難去除干凈產物中的催化劑，而且殘留的銅鹽也會帶來很大的毒性。其中一種有效的避免毒性的方法就是環炔基與疊氮的反應[16]，見圖1中b。在環炔基與疊氮的環加成反應中沒有使用金屬催化劑即銅鹽，它的反應機理主要是依靠環炔的環張力促進了疊氮與環炔進行反應，通過1,4,5-三取代的方式生成1,2,3-三唑環化合物。環炔基與疊氮的環加成反應速率與端炔基反應相比，在引入強吸電子基團(如氟原子等)后，環炔基與疊氮的環加成反應速率慢，是因為端炔基反應增大環炔的環張力，對環加成反應的進行有利，但是，此反應具有很不好的區域選擇性，且具有強環張力的環炔化合物難制備，通常會得到混合物——兩種異構產物，這也在一定程度上限制了此反應的應用。

2.2.3 巰基與碳碳多鍵的加成反應

巰基與碳碳多鍵的加成反應主要有兩種反應類型：巰基-雙鍵和巰基-三鍵，見圖3[17]。巰基-烯反應是由自由基引發的，其反應機理主要有以下幾個階段，即在光照或是熱的條件下吸收光子激發引發劑，形成自由基，由裂解而成；進而奪取一個巰基上的氫原子，形成巰基自由基；之后進攻碳碳雙鍵，使得活性中心被轉移，烷基自由基因此形成；烷基自由基繼續奪取巰基的氫原子在巰基化合物上，使得巰基自由基再次生成，然后進入循環。其中中間產生的巰基自由基既可以形成雙基的終止，也可以引發鏈的增長[18]。

圖3 巰基與雙鍵的反應原理Fig.3 The reaction principle of thiol with double bond

在20世紀30年代巰基-三鍵的反應被發現，但在Lowe，Bowman和Holye等[19,20]的密切合作下，發現巰基和三鍵的反應不是一步反應而是兩個過程，以巰基-炔為例，巰基與碳碳三鍵的反應經歷了巰基和三鍵的反應和巰基-烯反應，其反應過程見圖4。反應的第一階段是在光或熱催化作用下，光引發劑分裂，形成的自由基奪取硫醇化合物上的一個氫原子，形成了硫醇自由基，該自由基與烷基炔基團發生加成反應，形成中間體不穩定的硫醚-乙烯基自由基，附近的硫醇化合物被硫醚-乙烯基自由基奪取一個氫原子，再次形成中間體巰基烯基醚，其后的第二階段與巰基-烯反應過程相同，見圖3。

圖4 巰基與三鍵的反應原理Fig.4 The reaction principle of thiol with triple bond

2.2.4 非醇醛羰基化合物的縮合反應

非醇醛羰基化合物的縮合反應，又叫Diels-Alder反應，是點擊化學反應中的另一種高效且典型的反應類型[21]，見圖1中c。此反應主要是親雙烯體和共軛雙烯之間所發生的環加成反應。在一般的情況下，給電子取代基(在共軛雙烯體上)和吸電子取代基(在親雙烯體上)都可以加速反應，且這種反應的優點是產率高和立體選擇性好。此外，大多數此類反應都是可逆反應，它們的產物在較高的溫度下(高于正向非醇醛羰基化合物的縮合反應溫度)會發生逆反應，再分解成初始的共軛雙烯和親雙烯體。

3 點擊化學反應在食品成分分析檢測中的應用進展

3.1 基于點擊化學反應構建食品分析檢測生物傳感器的進展

點擊化學在檢測食品分析上已有了一些研究和應用，多用于檢測常見的食品成分和食品添加劑。抗壞血酸近年來作為添加劑常用于食品的護色[22，23]。Qiu等[24]制備了一種電化學傳感器用于檢測抗壞血酸，通過銅(I)催化疊氮化物和炔烴環加成反應與疊氮化物末端修飾的金電極反應，結果表明，檢出限達到2.60×10-12mol/L。李燕萍等[25]構建出了兩種不同的利用巰基丙酸修飾納米金的功能性納米金粒子，即通過酰胺反應分別固定炔基和疊氮基在納米金上，然后實現對還原糖的定量檢測(構建原理見圖5)。結果表明，檢出限達到1.50×10-3μmol/L。然后可以直接檢測實際蜂蜜樣品，且加標回收率是98.1%～0.36%，與滴定法加標回收率>95%相比靈敏度更高[26]。

圖5 利用疊氮反應檢測還原糖的機理圖Fig.5 The mechanism diagram of determination of reducing sugar by azide reaction

點擊化學對傳感器性能的提高也有發展。Wang等[27]開發了一種將分子印跡聚合物(MIP)薄層接枝到金電極上的三步方法(見圖6)，對于對苯二酚的檢測，可實現比傳統的涂層式MIP傳感器靈敏的效果。點擊式MIP傳感器的檢測限為(1.21±0.56)mol/L，大約比使用涂層式MIP傳感器觀察到的檢測限低4倍。此外，用計時安培法測定的表觀擴散系數表明，點擊式MIP傳感器的靈敏度大約是涂層式MIP傳感器的3倍。Qiu等[28]以個人血糖儀(PGM)為信號傳感器制備了檢測OTA的一種新型的便攜式檢測系統。以短dsDNA作為模板觸發兩條DNA鏈的點擊反應，OTA檢測靈敏度高達7.2×10-9g/L。背景信號減少了7.5倍，靈敏度和選擇性都大大提高，可以應用于飼料樣品中OTA的檢測。

圖6 利用疊氮反應制備MIP修飾的Au電極檢測食品中的酚類物質Fig.6 MIP-modified Au electrode using azide reaction for the determination of phenols in food

點擊反應也應用于食品污染物的檢測。Lu等[29]設計了一種高靈敏度和高選擇性檢測農藥氟美沙嗪殘留的方法，以弱熒光化合物3-疊氮-7-羥基香豆素與氟米沙嗪中的炔基通過銅催化的疊氮烷基的環加成的點擊反應，形成強熒光化合物(1,2,3-三唑類化合物)為基礎的靈敏度、選擇性好的丙烯氟草胺熒光傳感器。在0.25～6.00 μg/L范圍內，檢測限為0.18 μg/L(s/n=3)。將該熒光傳感器應用于一些蔬菜和水樣中氟美沙嗪的殘留檢測，取得了良好的實驗結果。Ji等[30]采用點擊反應法制備了含三唑類化合物的聚合物，并將其作為Hg2+離子檢測的熒光傳感器。三唑類聚合物具有良好的溶解性和高分子量，通過FTIR、NMR、FL和DLL分析對聚合物的結構和性能進行了表征和評價。與其他金屬離子相比，Hg2+的熒光響應最為明顯。結果表明，檢測Hg2+的濃度范圍為3.0×10-5～10×10-4mol/L, R=0.9989，該三唑類聚合物具有良好的點擊反應特性，可作為Hg2+檢測的選擇性熒光傳感器。與原子吸收法相比[31]，能檢測更大濃度的Hg2+。

3.2 點擊化學反應在食品分析前處理技術改良中的研究進展

點擊化學在前處理技術中普遍應用在物質的分離提純中。Zhang等以五氟芐基溴化咪唑離子液體為原料，通過硫醇烯鍵合反應，首次合成了具有多種吸附機理的石墨烯吸附劑，建立了一種可以同時提取和測定豆芽中3種生長素的新方法[32]。結果表明，吲哚-3-乙酸和1-萘乙酸的線性范圍為0.03～5.00 μg/g，2,4-二氯苯氧乙酸的線性范圍為0.09～5.00 μg/g，檢出限為0.004～0.026 μg/g，且該吸附劑已成功應用于豆芽生長素的測定。蔡曉蓉[33]制備了離子液體聚合物整體柱，可以滿足快速分離堿性、弱極性和中性化合物的要求。實驗是基于巰基-烯點擊反應聯合自由基原位聚合技術(反應原理見圖7)。以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，以十八烷基硫醇(R2)和1-烯丙基-3-甲基咪唑四氣硼酸鹽(R1)離子液體為有機單體，在聚合反應中加入引發劑偶氮二異丁腈和三元致孔劑，一步合成離子液體聚合物整體柱。

圖7 有機聚合物整體柱的反應機理Fig.7 The reaction mechanism of organic polymer monolithic column

4 結論與展望

點擊化學反應是一類以創造和實現新功能物質和新材料為目的的簡單合成方式。其在很多領域已取得成功，并且將會持續發展。隨著點擊化學在各個領域的深入研究，由于其生物相容性和環境友好性的特點，未來必將在發展中占據重要地位。目前點擊化學在食品領域已經有了一定的發展，然而對于點擊化學的開發和應用都還處于初期階段，并且現階段的點擊化學應用也存在一些問題值得重視，即每種點擊化學反應都有其本身的局限性，例如銅鹽的使用，需加入過量的反應物才可以使反應進行完全；以及疊氮化合物(尤其是小分子化合物)的高危險性和毒性等。此外，現階段已被報道的大多數是疊氮化物與端基炔的環加成反應的應用。近些年來，對巰基-烯加成反應的報道逐漸增多，而對其他典型的點擊反應研究應用的報道非常少。因此，需要不斷探索能夠解決上述問題的新方法和新反應，才能更好地拓寬點擊化學的應用范圍，以期使點擊反應在更多方向和領域得到發展。