糖基化修飾對血紅蛋白在肉制品中穩定性的影響

馬利華，尤敦學，沈石星

(1.徐州工程學院 食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇久思鄉食品科技有限公司，江蘇 徐州 221018)

血紅蛋白是使血液呈紅色的一種蛋白，血紅蛋白在食品加工中應用非常廣泛，可以提高肉制品的彈性、風味以及組織狀態等[1,2]。

國外對血紅蛋白在肉制品中的應用研究較早，1976年Fox就提出了添加由血紅蛋白合成的亞硝基血色原可使腌肉制品獲得較穩定的粉紅色，因此可減少亞硝酸鹽的使用量[3]。Basu和Kumar將血紅蛋白與酸性紅色素相互作用制備改性血紅蛋白色素，結果發現兩者相互作用后會影響血紅蛋白吸收峰的褪色變化，并顯著淬滅血紅蛋白的固有熒光性[4]。國內雖然對血紅蛋白的研究較晚，但已初見成效。馬美湖成功合成了亞硝基血紅蛋白并成功地應用在香腸中，降低了亞硝酸鹽的含量[5]。

目前研究比較多的是亞硝基血紅蛋白著色劑，亞硝基血紅蛋白是由血紅蛋白與亞硝酸鈉或NO反應制得，常作為紅色素用于肉制品加工中，替代亞硝酸鹽的發色作用，明顯降低了肉制品中亞硝酸鹽的殘留量，增加了安全性[6,7]。但色素的分散性和熱穩定性均不理想，影響了實際使用效果。通過蛋白質和多糖在控制條件下的美拉德反應制備糖化血紅蛋白著色劑能明顯提高該新型著色劑的溶解性、光照和熱穩定性等性能[8]。

本課題主要是將動物血中的血紅蛋白糖基化改性，研究改性前后血紅蛋白穩定性的變化，為制作更為穩定、安全的色素提供了科學的理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

豬血：采購于菜市場。

1.2 試劑與設備

硫酸銨、氯化鈉、過氧化氫、硫代硫酸鈉、三氯化鐵、葡萄糖：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

WSC-S色差儀、7230G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TDL-80-2B臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 血紅蛋白的提取以及糖基化

稱量20 g左右的豬血于燒杯中，加入40 mL蒸餾水，將豬血和水用高速組織搗碎機搗碎，然后加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置3 h。用離心機離心，轉速4000 r/min，完成后去上清液即為血紅蛋白，干燥后稱其質量[9]。

將血紅蛋白和葡萄糖質量比在1∶3的條件下，加入適量蒸餾水，用NaOH溶液調節pH至8.0左右，在75 ℃水浴加熱2 h,冷卻后加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置3 h，在轉速4000 r/min的條件下離心30 min，去上清液即為糖基化血紅蛋白[10]。

1.3.2 游離氨基酸和接枝度的測定

采用茚三酮比色法測定血紅蛋白反應前后的游離氨基酸[11]。采用接枝度衡量血紅蛋白糖基化效果[12]。

式中:C0為未反應時蛋白質自由氨基總量;Ct為反應后蛋白質自由氨基的含量。

1.3.3 糖基化血紅蛋白穩定性的測定

在200～600 nm每10 nm測定一次吸光值，選取最大吸光值，進行糖基化血紅蛋白的穩定實驗，并計算保留率[13]。

式中：A為處理后溶液的吸光度；A0為處理前溶液的吸光度。

1.3.3.1 光對穩定性的影響

配制糖基化血紅蛋白溶液分別于日光燈、室內自然光和黑暗條件下放置6 d，每天測一次吸光度，計算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.2 溫度對穩定性的影響

將色素溶液分別置于室溫(25 ℃)，40，50，60 ℃的恒溫水浴中，每30 min測一次吸光度，共3 h，計算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.3 pH對穩定性的影響

將糖基化血紅蛋白溶液分別調節pH為3，5，7，9，然后測定吸光度，計算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.4 氧化還原劑對穩定性的影響

分別配制0.1%的過氧化氫以及硫代硫酸鈉的色素溶液，與室溫避光處放置1 h，每隔10 min測定一次吸光度，計算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.5 金屬離子對穩定性的影響

分別配制含有Fe2+、Al3+、Cu2+的糖基化血紅蛋白溶液，每種離子的質量濃度為100 mg/L，放在室內避光處6 d，每天測一次吸光度，計算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

1.3.3.6 食品添加劑對穩定性的影響

分別配制1%的NaCl和NaH2PO4的糖基化血紅蛋白溶液，于室內避光處存放2 h，每隔0.5 h測一次吸光度，計算糖基化血紅蛋白溶液的色素保留率。

2 實驗結果與分析

2.1 血紅蛋白糖基化

豬血質量為19.98 g，提取的血紅蛋白質量為15.32 g ，血紅蛋白接枝度DG=33.90%。

2.2 糖基化血紅蛋白穩定性研究

2.2.1 光對糖基化血紅蛋白穩定性的影響

圖1 光對糖基化血紅蛋白穩定性的影響Fig.1 The effect of light on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖1可知，糖基化血紅蛋白色素在不同光照條件下放置了6 d，3種條件的保留率都有所下降，在日光燈下的色素溶液下降幅度最大，比黑暗處放置下降40.86%；黑暗處放置則相對穩定，說明該色素在日光條件下色素發生氧化，穩定性變差。因此，在加工過程中應盡量避免強光直射。

2.2.2 溫度對穩定性的影響

圖2 溫度對糖基化血紅蛋白穩定性的影響Fig.2 The effect of temperature on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖2可知，隨著時間的增加，各個溫度下的糖基化血紅蛋白色素的保留率都趨于下降，30 ℃下吸光度變化最小，150 min 處理后色素保留率在65%以上，60 ℃處理色素保留率最低，150 min 處理后僅為36.32%，說明該色素在60 ℃以下比較穩定，可進行生產和加工。

2.2.3 pH對穩定性的影響

圖3 pH對糖基化血紅蛋白穩定性的影響Fig.3 The effect of pH on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖3可知，色素在pH 3～7時保留率逐漸上升，當pH為7～9時吸光度值處于最大，隨后開始下降，說明該色素在酸性條件下呈色力強，在堿性條件下其結構可能發生了變化，導致色素被破壞。

2.2.4 氧化還原劑對穩定性的影響

圖4 氧化還原劑對糖基化血紅蛋白穩定性的影響Fig.4 The effect of redox agents on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖4可知，隨著處理時間的延長，加入過氧化氫的糖基化血紅蛋白色素溶液的保留率下降，但總體變化不大，處理30 min后保留率僅下降10.42%，說明該色素抗氧化性較好，而加入硫代硫酸鈉的血紅蛋白溶液保留率下降相對明顯，處理30 min后保留率則下降了31.16%，表明該色素耐還原性比較差，因此生產與加工時應避免還原劑的介入。

2.2.5 金屬離子對穩定性的影響

由圖5可知，隨著時間的增加，金屬離子對色素的影響均較明顯，3種金屬離子處理后色素的保留率平均下降30.62%。Fe2+色素液的保留率下降最大，處理6 d后色素保留率比對照下降43.86%，而Al3+和Cu2 +的下降趨勢相對緩慢。說明Fe2+對色素有較大的影響，因此生產與加工時應避免鐵質器具的使用。

圖5 金屬離子對糖基化血紅蛋白穩定性的影響Fig.5 The effect of metal ions on the stability of glycosylated hemoglobin

2.2.6 食品添加劑對穩定性的影響

圖6 部分食品添加劑對糖基化血紅蛋白穩定性的影響Fig.6 The effect of some food additives on the stability of glycosylated hemoglobin

由圖6可知， 隨著時間的延長，加入食品添加劑對糖基化血紅蛋白溶液的保留率影響均不明顯，NaCl處理3 h后色素保留率僅下降5.12%，NaH2PO4處理3 h后色素保留率也僅下降9.61%，說明實驗所選氯化鈉和磷酸鹽兩種食品添加劑對該色素影響較小。

3 結論

本實驗對豬血血紅蛋白進行了糖基化改性，制備了綠色、穩定、安全的色素，該色素在光、溫度、pH、氧化還原劑、金屬離子、部分食品添加劑等條件下進行了穩定性實驗。結果表明糖基化改性后的血紅蛋白色素在30 ℃、酸性條件、部分食品添加劑等條件下處理都比較穩定，生產與加工時應避免高溫、強光照射、金屬離子尤其是Fe2+等。