貴州不同地區(qū)番茄紅酸理化、風味和細菌群落比較分析

李大飛，趙承鑫，賈利蓉，段飛霞，呂遠平，張浩巖

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

番茄紅酸也稱紅酸湯(酸湯的一種)，是一種以番茄和辣椒為主要原料，以白酒、甜酒和稀飯為輔料，經自然發(fā)酵制成的一種特色民族調味料，主要分布在我國貴州省苗族和侗族聚集地。與泡菜、酸筍一樣，番茄紅酸也是一種典型的乳酸發(fā)酵制品，因其獨特的風味和豐富的營養(yǎng)，近年來，番茄紅酸受到全國各地消費者的青睞。番茄紅酸含有大量有機酸，如乳酸、乙酸和檸檬酸等，具有開胃、助消化之功效[1]。同時，番茄紅酸含有大量的辣椒堿、番茄紅素，具有抗癌、預防心血管疾病等生理作用[2,3]。目前，關于貴州番茄紅酸，熊瑛等[4]利用高效液相色譜法對其有機酸進行了檢測，結果共檢測到5種有機酸；魯楊對凱里工業(yè)和作坊紅酸湯的主要營養(yǎng)成分和揮發(fā)性成分進行了比較研究，結果顯示工業(yè)產品中鈣、鎂、鉀等礦物質及檸檬醛、檸檬烯等風味化學物質均高于作坊產品；張璇[5]對貴州紅酸半成品的微生物進行培養(yǎng)，結果顯示乳桿菌為主要微生物。但關于來自不同地區(qū)番茄紅酸的理化、風味和微生物多樣性的比較分析尚未見相關報道。另外，近年來16S rRNA測序技術成為主流的細菌群落分析手段，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿培養(yǎng)法相比，能夠準確地獲取更多的細菌群落結構信息[6]。

因此，本研究以貴州凱里、石阡和畢節(jié)成熟的番茄紅酸樣品作為研究對象，依照國標方法分析其基本理化指標，采用高效液相色譜(HPLC)法對有機酸進行測定，使用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法對揮發(fā)性成分進行測定，利用16S rRNA對細菌群落結構進行研究，旨在對來自貴州不同地區(qū)番茄紅酸的理化、風味和微生物多樣性進行比較分析，為貴州酸湯的生產和產業(yè)發(fā)展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 采樣及樣品處理

采集貴州凱里市、石阡市和畢節(jié)市的成熟番茄紅酸樣品各3個。采用干冰運輸和-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 理化指標分析

pH的測定參考GB 5009.237-2016；總酸的測定參考GB/T 12456-2008中的電極法；氨基酸態(tài)氮的測定參考GB 5009.235-2016中的酸度計法；亞硝酸鹽的測定參考GB/T 5009.33-2008中的分光光度法。

1.3 有機酸分析

1.3.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II型液相色譜分析儀；Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，4 μm)；草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸標品，標品純度≥98%。

1.3.2 方法

樣品處理：先稱取5.0 g樣品，加入蒸餾水定容至50 mL，再于50 ℃超聲處理30 min，隨后用快速濾紙過濾，離心處理，吸取上層清液，0.22 μm微孔濾膜過濾。

分析過程：以97.5%的去離子水和2.5%的甲醇混合溶液為流動相，40 ℃柱溫，20 min總分析時長。用相同程序分析不同濃度梯度的有機酸混合標品，根據峰面積與實際濃度制作標準曲線。

1.4 揮發(fā)性成分分析

1.4.1 儀器與試劑

C4～C25正構烷烴混合標品、20 mL頂空瓶、DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及配套手柄、GC-MS(島津公司)、Rxi-5MS色譜柱(長度30 m，膜厚0.25 μm, 內徑0.25 mm)、水浴鍋。

1.4.2 分析程序

準確稱取各組樣品3.0 g于20 mL頂空瓶中。 60 ℃下水浴頂空平衡30 min，然后用萃取頭吸附20 min，吸附后進樣，測定揮發(fā)性成分。

GC條件：氦氣流速為1.0 mL/min，起始柱溫40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min的速度升溫至65 ℃，保持1 min；再以3 ℃/min的速度升溫至120 ℃，保持1 min；然后以5 ℃/min的速度升溫至160 ℃，保持1 min；最后以20 ℃/min的速度快速升溫至290 ℃。

MS條件：GC-MS 接口溫度 220 ℃；EI 離子源；離子源溫度200 ℃；掃描范圍30～500 m/z。

1.4.3 定性方法

以C4～C25正構烷烴混合標品計算各峰的保留指數。比對NIST08.LIB數據庫，保留相似度≥85，且計算保留指數與數據庫中保留指數相差不超過30以內的成分。相似度≥90的成分也予以保留。

1.5 細菌群落結構分析

1.5.1 DNA抽提和PCR擴增

參照E.Z.N.A.Soil DNA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說明書對樣品進行DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop 2000測定DNA 濃度和純度；使用2輪引物對 16S rRNA基因V5～V7可變區(qū)進行PCR擴增，引物序列見表1。擴增程序：95 ℃ 預變性 3 min，15個循環(huán)(95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，然后在 72 ℃ 穩(wěn)定延伸 10 min，最后在4 ℃進行保存(PCR 儀：ABI GeneAmp 9700型)。PCR反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL，下游引物(5 μmol/L)0.8 μL， TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 The amplified primer sequence of PCR

1.5.2 測序及數據處理

測序步驟參照Illumina MiSeq平臺(Illumina,San Diego，USA)標準操作規(guī)程使用的UPARSE 軟件，對序列進行 OTU 聚類，相似度為97%；使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋，比對NT數據庫，設置比對閾值為70%。

2 結果與分析

2.1理化指標

圖1 不同地區(qū)番茄紅酸基本理化指標對比Fig.1 Comparison of the basic physicochemical indicators of TSS from different regions

由圖1 可知，3個地區(qū)番茄紅酸的pH、總酸、亞硝酸鹽均存在顯著差異(P<0.05)。pH值從高到低依次為：石阡市(3.79)>凱里市(3.35)>畢節(jié)市(3.19)。凱里、石阡和畢節(jié)番茄紅酸總酸含量(以乳酸計)分別為26.93，20.07，29.02 g/kg，這與pH值的測定結果一致。亞硝酸鹽作為發(fā)酵食品中嚴格限量的指標，在凱里、石阡和畢節(jié)番茄紅酸中的含量分別為2.67，5.49，2.13 mg/kg，均低于GB 2762-2017中對果蔬及其制品的限定(20 mg/kg)。氨基酸態(tài)氮含量的大小可以反映游離氨基酸含量的高低，是番茄紅酸的重要指標之一。由圖1可知，石阡、凱里和畢節(jié)3個地區(qū)番茄紅酸氨基酸態(tài)氮含量依次降低，分別為0.3%、0.29%和0.26%，差異不明顯。pH和總酸的差異與發(fā)酵程度有很大的關系，亞硝酸鹽的含量與乳桿菌存在關系，研究表明乳桿菌能夠有效地降低亞硝酸鹽含量[7]。因此，石阡番茄紅酸的亞硝酸鹽含量相對更高，可能與其更低的Lactobacillus相對含量有關。

2.2 有機酸

利用HPLC對番茄紅酸的有機酸進行測定，共測得7種有機酸，見圖2。

圖2 不同地區(qū)番茄紅酸有機酸含量對比Fig.2 Comparison of organic acids of TSS from different regions

由圖2可知，乳酸、乙酸、檸檬酸為番茄紅酸的3種主要有機酸。凱里番茄紅酸的乳酸含量最高，達到24.36 g/kg，乙酸和檸檬酸含量分別為6.68 g/kg和4.75 g/kg。石阡番茄紅酸含量最高的有機酸為乙酸(12.53 g/kg)，乳酸和檸檬酸含量分別為8.7 g/kg和8.87 g/kg。畢節(jié)番茄紅酸含量最高的為乳酸(14.5 g/kg)，檸檬酸和乙酸含量分別為12.75 g/kg和6.45 g/kg。不難發(fā)現，雖然3個地區(qū)番茄紅酸的主要有機酸均為乳酸、乙酸和檸檬酸，但是其比例結構存在差異。凱里和畢節(jié)番茄紅酸乳酸含量最高，而石阡番茄紅酸中乙酸含量最高，原因可能與微生物群落和代謝情況存在差異有關。自然發(fā)酵產品中微生物群落結構受地理環(huán)境因素影響，而不同微生物的代謝情況差異很大，即使相同的菌株在不同的環(huán)境代謝情況同樣會存在差異[8]。

2.3 揮發(fā)性成分

利用固相微萃取吸附揮發(fā)性成分，采用GC-MS對風味成分進行定性和定量分析，見圖3。

圖3 不同地區(qū)番茄紅酸揮發(fā)性成分對比Fig.3 Comparison of volatile components of TSS from different regions

一共定性出89種成分，包括17種醇、10種酸、34種酯、16種烴、4種酚、3種酮、2種醚、1種醛和2種雜環(huán)類化合物，見表2。醇類物質除了與添加白酒和甜酒存在關系外，可能還與酵母的代謝有關。酸類物質是細菌的常見代謝產物，比如乳桿菌屬等，除了能夠代謝生成乳酸外，也能代謝生成乙酸、檸檬酸等其他有機酸[9]。酯類物質主要是由醇和酸發(fā)生酯化反應生成[10]。

表2 不同地區(qū)番茄紅酸揮發(fā)性成分 Table 2 Volatile components of TSS from different regions

續(xù) 表

續(xù) 表

注：“SI”為相似度；“a”為數據庫保留指數；“b”為計算保留指數；“-”表示未檢出。

由表2和圖3可知，3個地區(qū)的番茄紅酸揮發(fā)性成分構成存在顯著差異。醇、酸、酯為凱里和石阡番茄紅酸的主體風味，但是構成比例差異顯著。而畢節(jié)番茄紅酸除了含有大量的醇、酸、酯外，還含有大量的烴類物質。烴類物質中的烯萜類，如姜烯廣泛存在于生姜等香辛料中[11]。因此畢節(jié)番茄紅酸的大量烴類成分可能與發(fā)酵過程中加入較多的香辛料有關。

2.4 細菌群落結構

圖4 不同地區(qū)番茄紅酸細菌群落對比Fig.4 Comparison of the bacterial communities of TSS from different regions

通過提取番茄紅酸中的DNA進行PCR擴增后，利用Illumina測序平臺進行測序。測序深度最低為13895條，稀釋曲線表明測序深度足夠。一共檢測到9個門，40個屬。由圖4可知，從門水平上看，凱里和畢節(jié)番茄紅酸的優(yōu)勢菌為Firmicutes，其平均相對百分含量分別達到99.21%和98.73%；石阡的番茄紅酸優(yōu)勢菌為Firmicutes，Thermotogae，Actinobacteria和Bacteroidetes，其平均相對含量分別為71.48%、13.24%、8.17%和3.82%。從屬水平上看，凱里和畢節(jié)番茄紅酸的優(yōu)勢菌為Lactobacillus，其相對含量達到了99.03%和98.43%；石阡的番茄紅酸優(yōu)勢菌為Lactobacillus，Oceanotoga，Corynebacterium和Pediococcus，其平均相對含量分別為62.80%、13.24%、8.17%和6.41%。Lactobacillus和Pediococcus常見于其他乳酸發(fā)酵制品中[12]。Oceanotoga作為一類嗜熱細菌，常見于煤礦、污泥和海底中，可能與產甲烷等氣體相關，而在酸食發(fā)酵制品中出現很少[13]。Corynebacterium菌屬的某些菌株常用來生產氨基酸[14]。

通過比較可以看出，凱里和畢節(jié)番茄紅酸的細菌群落結構更加單一，Lactobacillus為絕對優(yōu)勢菌屬。而石阡番茄紅酸群落結構更豐富，除了Lactobacillus作為優(yōu)勢菌屬外，Oceanotoga，Corynebacterium和Pediococcus相對含量同樣很高。造成此差異的原因可能是自然環(huán)境和發(fā)酵工藝存在差異，石阡番茄紅酸發(fā)酵前期乳酸桿菌相對含量較低，存在大量非乳酸桿菌的大量繁殖[15]。

3 結論

對凱里、石阡和畢節(jié)3個地區(qū)的番茄紅酸在理化指標、有機酸、揮發(fā)性成分和細菌群落結構方面進行分析。檢測出這3個地區(qū)的pH值分別為3.35，3.79，3.19；總酸含量分別為26.93，20.07，29.02 g/kg；亞硝酸鹽含量分別為2.67，5.49，2.13 mg/kg；氨基酸態(tài)氮含量分別為0.3%、0.29%和0.26%。檢測到7種有機酸，分別為草酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。檢測到出89種揮發(fā)性成分，其中包括17種醇、10種酸、34種酯、16種烴、4種酚、3種酮、2種醚、1種醛和2種雜環(huán)類化合物。檢測到9個細菌門和40個細菌屬。

3個地區(qū)番茄紅酸的pH、總酸和亞硝酸鹽均存在顯著差異；醇類、酸類和酯類成分為凱里和畢節(jié)番茄紅酸的主體揮發(fā)性風味成分，石阡番茄紅酸除含大量的醇、酸和酯外，還含有大量的烴類；凱里和畢節(jié)番茄紅酸優(yōu)勢細菌屬為Lactobacillus，含量分別高達99.03%和98.43%，石阡番茄紅酸優(yōu)勢菌為Lactobacillus，Oceanotoga，Corynebacterium和Pediococcus，其平均相對含量分別為62.80%、13.24%、8.17%和6.41%。