響應面法優化美味牛肝菌多酚的提取工藝研究

郭磊，孫琪，保瑞景，譚大聰，華燕，闞歡

(1.西南林業大學 云南森林資源培育與利用協同創新中心，昆明 650224；2.西南林業大學 生命科學學院，昆明 650224)

美味牛肝菌(BoletusedulisBull. Fr.)是一種世界范圍內分布的著名的野生菌，兼具食藥用經濟價值[1,2]。中國是美味牛肝菌的主要分布區域, 尤其在云南分布廣泛[3]。美味牛肝菌含有豐富的蛋白質、還原糖和氨基酸等營養物質，其中呈鮮味的天門冬氨酸和谷氨酸占總氨基酸含量的25.4%[4,5]。美味牛肝菌還含有多糖、黃酮和多酚等生物活性成分，而多酚是一類具有多個酚羥基的次生代謝產物，對人體健康有著許多有益的作用，如對阿爾茨海默病、心血管疾病和改善腸道微生物菌群等的保護作用[6-8]，近年來已成為研究熱點。芒果皮多酚、花椒多酚、甘蔗多酚、生姜多酚、百里香多酚等植物多酚[9-13]的提取及抗氧化研究已有報道，但關于美味牛肝菌多酚的研究還鮮有報道，這不僅限制了美味牛肝菌多酚的生物活性研究，也限制了美味牛肝菌資源特別是功能性調味料的開發應用。

本研究以美味牛肝菌試驗對象，以多酚提取率為試驗指標，考察了液料比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度及提取次數對多酚提取率的影響，并在此基礎上進行響應面優化美味牛肝菌多酚的最佳提取工藝，為美味牛肝菌多酚資源及功能調味料的開發利用提供了一定的理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌：購自云南易門縣康源菌業有限公司；沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、無水乙醇：以上均為分析純。

UV-VIS 300紫外分光光度計 美國賽默飛世爾科技有限公司；BAS2245電子天平 德國賽多利斯集團；HH-2數顯電子恒溫水浴鍋 金壇市丹瑞電器廠；3K15低溫離心機 德國西格瑪公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制作

參照侯玉艷的方法略微修改[14]。準確量取濃度為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL沒食子酸溶液0.5 mL，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L福林酚試劑搖勻后避光靜置5 min，再加入2.0 mL 7.5% Na2CO3溶液搖勻靜置1 h后在765 nm處測定吸光值，同時以蒸餾水為空白。以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=18.56C+0.015，R2=0.995。

1.2.2 美味牛肝菌多酚的提取

美味牛肝菌子實體經干燥、粉碎、過篩后備用。以多酚提取率為試驗指標，采用單因素試驗，研究液料比(mL/g)、乙醇體積分數(%)、提取時間(min)、提取溫度(℃)及提取次數對多酚提取率的影響。影響多酚提取率的因素設以下水平：固定乙醇體積分數50%，提取時間 90 min，提取溫度50 ℃，提取2次，考察不同的液料比20，25，30，35，40 (mL/g)對多酚提取率的影響；固定液料比35 (mL/g)，提取時間90 min，提取溫度50 ℃，提取2次，考察不同乙醇體積分數(45%、50%、55%、60%、65%)對多酚提取率的影響；固定液料比35(mL/g)、乙醇體積分數50%、提取溫度50 ℃、提取2次，考察不同提取時間(30，60，90，120，150 min)對多酚提取率的影響；固定液料比35 (mL/g)、乙醇體積分數50%、提取時間90 min、提取2次，考察不同提取溫度(35，40，45，50，55 ℃)對多酚提取率的影響；固定液料比35(mL/g)、乙醇體積分數50%、提取時間90 min，提取溫度45 ℃，考察不同提取次數(1，2，3次)對多酚提取率的影響。

1.2.3 多酚含量的測定

多酚提取液經抽濾后按照1.2.1的方法測定吸光值，計算出美味牛肝菌多酚的提取率。

提取率(%)=[(C×V×n)/(m×1000)]×100。

(1)

式中：C為美味牛肝菌提取液中多酚的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；m為美味牛肝菌質量，g。

1.2.4 響應面優化試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，選取對美味牛肝菌多酚提取率影響較大的因素液料比(A，mL/g)、乙醇體積分數(B，%)、提取時間(C，min)和提取溫度(D，℃)，每個因素設置3個水平，利用Box-Behnken響應面設計方法，試驗因素水平設置見表1。

使用數據分析軟件Design Expert 8.0.6進行數據分析，通過F檢驗對試驗數據進行方差分析以評價模型的統計意義并進行驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 響應面回歸模型的建立及分析

在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behenken試驗設計原理，選取液料比(A)、乙醇體積分數(B)、提取時間(C)和提取溫度(D)為自變量，美味牛肝菌多酚提取率(Y)為響應值，設計四因素三水平響應面試驗。響應面試驗設計方案與數據處理結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

續 表

采用Design Expert 8.0.6對所得數據進行回歸分析，回歸結果分析見表3，對4個因素進行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y =1.34+0.050A+0.031B-0.013C+0.0065D+0.025AB+0.0045AC-0.014AD+0.016BC+0.0095BD+0.0050CD-0.062A2-0.049B2-0.030C2-0.054D2。

(2)

對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

續 表

注：“*”代表顯著，P<0.05；“**”代表非常顯著，P<0.01。

由表3可知，該模型顯著(P<0.05)，失擬項不顯著(P>0.05)。通過模型的回歸方差分析結果可以看出，一次項中液料比(A)對多酚提取率的影響非常顯著(P<0.01)，乙醇體積分數(B)對多酚提取率的影響顯著，而提取時間(C)和提取溫度(D)對多酚提取率的影響不顯著。二次項A2和D2對多酚提取率的影響非常顯著，B2對多酚提取率的影響顯著。交互項對多酚提取率的影響均不顯著。由P值可知，各因素對美味牛肝菌多酚提取率影響的大小順序為：液料比(A)>乙醇體積分數(B)>提取時間(C)>提取溫度(D)。

2.2 響應面分析

液料比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度對美味牛肝菌多酚提取率影響的響應面圖見圖1。

圖1 兩因素間交互作用對多酚提取率的響應面圖Fig.1 Response surface plots of interaction of two factors on extraction rate of polyphenols from Boletus edulis

圖1分別反映了液料比和乙醇體積分數、液料比和提取時間、液料比和提取溫度、乙醇體積分數和提取時間、乙醇體積分數和提取溫度、提取時間和提取溫度對美味牛肝菌多酚提取率的交互影響效應。由圖1可知，響應面圖都比較陡峭，說明美味牛肝菌多酚的提取率隨其中任意兩個變量的增加均呈現上升趨勢。

2.3 驗證試驗

對回歸方程(1)求解，即美味牛肝菌多酚提取率達到最大值的工藝條件為：液料比37.44 (mL/g)、乙醇體積分數57.20%、提取時間88.06 min、提取溫度45.16 ℃、提取2次，在此條件下多酚的提取率為1.36%。為方便實際操作將試驗條件調整為液料比37 (mL/g)、乙醇體積分數57%、提取時間90 min、提取溫度45 ℃，提取2次、通過驗證得出美味牛肝菌多酚的平均提取率為1.33%，與理論值相差0.03%，與模型預測值相近，說明該回歸模型與實際試驗過程匹配程度高，可以有效地優化美味牛肝菌多酚的提取工藝。

3 結論

在單因素試驗結果的基礎上，選擇影響美味牛肝菌多酚提取率的4個因素(液料比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度)為自變量，采用四因素三水平響應面設計優化多酚的最佳提取工藝。通過驗證試驗得出在液料比37(mL/g)、乙醇體積分數57%、提取時間90 min、提取溫度45 ℃、提取2次的條件下，美味牛肝菌多酚的提取率達到1.33%±0.02%。研究結果為美味牛肝菌多酚及功能性調味料的資源開發利用提供了一定的理論依據。