癌相關(guān)成纖維細(xì)胞與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴轉(zhuǎn)移及淋巴管生成的相關(guān)性研究

陳 超，田翔宇，邱 森，王 潼，韓俊雅，陳奎生

食管癌是一種起源于食管黏膜上皮或食管腺上皮的惡性腫瘤，且經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移多見(jiàn)，主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)兩種亞型，這兩種亞型的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和病理特征均不相同。根據(jù)國(guó)際癌癥研究署發(fā)表的GLOBOCAN 2018研究顯示[1]，2018年有57.2萬(wàn)人新診斷為食管癌，同時(shí)又有50.9萬(wàn)人死于食管癌，在所有腫瘤中分別排在第七位和第六位。同時(shí)，在食管癌患者中還存在明顯的地域差異，以東亞地區(qū)最為多見(jiàn)，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家相對(duì)較少，而中國(guó)是食管癌發(fā)病大國(guó)，根據(jù)WHO實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，我國(guó)食管癌患病率和死亡率都排在全球第五位，但因我國(guó)龐大的人口基數(shù)，食管癌新發(fā)患者和死亡患者都占全球的55%左右，且以食管鱗狀細(xì)胞癌為主[2]。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其特異性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)。有大量證據(jù)表明，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和最終擴(kuò)散中起著重要作用[3]。對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的體外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和遷移在很大程度上取決于活化成纖維細(xì)胞的存在[4]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的CAFs的浸潤(rùn)情況并計(jì)算微淋巴管密度(microlymphatic vessel density,MLVD)，探討食管鱗狀細(xì)胞癌中CAFs與淋巴轉(zhuǎn)移及淋巴管生成的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本研究樣本取自河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院2012年5月至2015年5月手術(shù)切除并病理確診的食管鱗狀細(xì)胞癌的新鮮組織。選取新鮮無(wú)壞死食管鱗狀細(xì)胞癌組織53例，正常食管黏膜組織25例(取材距癌灶>5 cm)。患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①病理類型確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；②手術(shù)前未經(jīng)放療化療及其他治療；③病歷資料完整可靠。臨床分期根據(jù)2017年第八版UICC/AJCC食管癌的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定[5]。D2-40抗體試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔anti-α-SMA單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔Streptavidin-HRP試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)，小鼠二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法所有組織樣本均于離體2 h內(nèi)用無(wú)菌生理鹽水清洗并用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片(4 μm)、烤片、脫蠟水化、高壓修復(fù)抗原(α-SMA采用檸檬酸鈉緩沖液 pH6.0，D2-40采用EDTA pH 9.0)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SP法染色，蘇木素復(fù)染、脫水透明、中性樹(shù)膠封片，室溫下晾曬24 h。顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 CAFs計(jì)數(shù)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞即為CAFs。用顯微鏡于低倍鏡(10×10倍)下觀察免疫組織化學(xué)染色切片，選取陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的密集區(qū)，即為“熱區(qū)(hot spot)”，再于高倍鏡(40×10倍)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)各個(gè)視野中表達(dá) α-SMA的細(xì)胞數(shù)，取平均值即為每高倍鏡(high power lens,HP)視野下CAFs數(shù)。

1.3.2 MLVD計(jì)數(shù)D2-40陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞即為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。用顯微鏡于低倍鏡(10×10倍)下觀察免疫組織化學(xué)染色切片，選取新生淋巴管密集的區(qū)域，即為“熱區(qū)”，再于高倍鏡(40×10倍)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)各個(gè)視野中微淋巴管的數(shù)量，取平均值即為每高倍鏡視野下MLVD。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管黏膜組織中CAFs計(jì)數(shù)α-SMA作為CAFs的特異性標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，α-SMA的表達(dá)情況即可反映CAFs的浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示：食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量明顯多于正常食管黏膜組織(P<0.05)，CAFs在兩種不同組織中的浸潤(rùn)情況見(jiàn)表1，在兩種不同組織中的染色情況見(jiàn)圖1。

表1 CAFs在兩種不同組織中的浸潤(rùn)情況

A：正常食管黏膜組織(SP法，×100)；B：食管鱗狀細(xì)胞癌組織(SP法，×100)。圖1 CAFs在兩種不同組織中的浸潤(rùn)情況

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量明顯多于正常食管黏膜組織，因此，本研究進(jìn)一步探討在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系。表2結(jié)果顯示，CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與食管鱗狀細(xì)胞癌患者的性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs數(shù)量與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及正常食管黏膜組織中D2-40的表達(dá)(MLVD)情況D2-40作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒，D2-40的表達(dá)情況即可反映淋巴管的生成情況，即微淋巴管密度(MLVD)。結(jié)果顯示：食管鱗狀細(xì)胞癌組織中MLVD計(jì)數(shù)明顯多于正常食管黏膜組織(P<0.05)，淋巴管在兩種不同組織中的生成情況見(jiàn)表3，在兩種不同組織中的染色情況見(jiàn)圖2。

表3 D2-40在兩種不同組織中的表達(dá)情況(MLVD)

A：正常食管黏膜組織(SP法，×100)；B：食管鱗狀細(xì)胞癌組織(SP法，×100)。圖2 淋巴管在兩種不同組織中的生成情況

2.4 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs數(shù)量與MLVD計(jì)數(shù)之間的關(guān)系食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與MLVD計(jì)數(shù)均明顯高于正常食管黏膜組織，且對(duì)53例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與MLVD計(jì)數(shù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析顯示，r值為0.632(P<0.05)，兩項(xiàng)數(shù)值呈正相關(guān)。

3 討論

目前食管鱗狀細(xì)胞癌分子機(jī)制的初步研究主要集中在腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在特征，即癌基因的激活和抑癌基因的失活。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞的外在因素，即腫瘤微環(huán)境，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要組成部分[6-7]。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤存在的細(xì)胞環(huán)境，包括周圍血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓來(lái)源的炎性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)[8]。腫瘤與周圍微環(huán)境密切相關(guān)，相互作用不斷。腫瘤可以通過(guò)釋放細(xì)胞外信號(hào)、促進(jìn)腫瘤血管生成和誘導(dǎo)外周免疫耐受來(lái)影響微環(huán)境，而微環(huán)境中的各類間質(zhì)細(xì)胞和生物活性物質(zhì)可以影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。CAFs是腫瘤微環(huán)境中腫瘤基質(zhì)的主要組成部分，其不僅作為結(jié)構(gòu)骨架為腫瘤細(xì)胞提供機(jī)械支持，更可以通過(guò)旁分泌途徑、外泌體途徑、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)途徑以及細(xì)胞外基質(zhì)重塑等方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究中，通過(guò)對(duì)CAFs的標(biāo)記蛋白α-SMA進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，了解其在組織中的浸潤(rùn)情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明CAFs在食管癌鱗狀細(xì)胞癌組織中的浸潤(rùn)數(shù)量明顯多于正常食管黏膜組織。將CAFs在食管癌鱗狀細(xì)胞癌組織中的浸潤(rùn)情況與患者的臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與臨床分期、浸潤(rùn)深度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道相似，推測(cè)CAFs在食管鱗狀細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

有大量證據(jù)表明，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和最終擴(kuò)散中起著重要作用，CAFs能夠通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等細(xì)胞外基質(zhì)成分參與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、增殖以及轉(zhuǎn)移等過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，CAFs能夠分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)，TGF-β信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生中起著雙重作用，即在腫瘤早期階段抑制其生長(zhǎng)，但后來(lái)則促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。在對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的器官型培養(yǎng)模型的研究中發(fā)現(xiàn)，CAFs分泌的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)對(duì)于腫瘤細(xì)胞侵襲是必需的，且應(yīng)用siRNA和藥物抑制HGF/c-Met信號(hào)通路可以有效地阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲[11]。在缺氧等環(huán)境條件的影響下，腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞，特別是CAFs，能夠分泌活化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，有研究顯示食管癌中存在VEGF-A的高表達(dá)，且一些研究表明在食管鱗狀細(xì)胞癌中VEGF-A的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)[12]。本研究通過(guò)對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白D2-40進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并對(duì)組織進(jìn)行MLVD計(jì)數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明MLVD在食管癌鱗狀細(xì)胞癌組織中明顯高于正常食管黏膜組織，說(shuō)明在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中淋巴內(nèi)皮的增殖明顯。對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs的浸潤(rùn)數(shù)量與MLVD進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)。由此推測(cè)，CAFs能夠促進(jìn)淋巴管生成，進(jìn)而參與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

目前食管癌的標(biāo)準(zhǔn)療法仍局限于手術(shù)或內(nèi)鏡切除以及放化療，但食管癌的預(yù)后仍然很差，5 a生存率約為15%～25%[13]，這主要是由于未能及時(shí)診斷或判斷轉(zhuǎn)移傾向。本研究結(jié)果表明，CAFs與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為關(guān)系密切且可能發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步探索CAFs在其中作用的具體機(jī)制，對(duì)于食管鱗狀細(xì)胞癌的早期預(yù)防和靶向治療具有重要意義。