藏藥黃堇分子生物學(xué)鑒定方法的建立＊

（西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩 850000）

0.引言

紫堇屬（Corydalis）植物全世界約428種，廣布于北溫帶地區(qū)；我國約298種，其中特有種，達(dá)219種之多。我國西南地區(qū)分布最多，青藏高原分布有120余種，其中西藏地區(qū)達(dá)94種，廣泛入藏醫(yī)藏藥使用[1]。

黃堇(Cordalis Pallida(Thunb.) 別名巖黃連、糞桶草等，屬罌粟科、紫堇屬、黃堇種叢生性—年草本植物。在我國有著廣泛的分布，半耐陰，不耐高溫強(qiáng)光和干旱，喜長于林間空曠地、墻角、河溝岸旁等比較蔭涼潮潤地處。產(chǎn)西藏（拉薩、嘉黎、索縣、巴青、類烏齊），生于海拔(3000) 3800m～5500m的河灘地。具有殺蟲、清熱、解毒、利尿等攻效[2]，可用于治療疥癬、目赤、流火、署熱瀉痢、肺病咳血、肺炎、肝炎、傷風(fēng)感冒等疾病[3]。該植物半圓形墊狀草本，黃綠色，高約5cm～13cm，有主根，主根約20cm左右。莖多數(shù)，分枝具葉，近肉質(zhì)。葉黃綠色。總狀花序生莖、亮黃色，頂端暗紫色。萼片腎形，淺黃色，約0.5mm。外花瓣具雞冠狀突起。

傳統(tǒng)的藥材鑒定，主要采用形態(tài)鑒定、理化性狀鑒定、顯微鑒定等方法。這些方法的鑒定都是基于生物的外在表現(xiàn)，而生物的外在表現(xiàn)性狀不僅受到遺傳基因的影響，還會受到外界環(huán)境條件、生長發(fā)育階段和人類干預(yù)等的影響，這些外界條件會干擾人類對植物的鑒定，因此具有一定的局限性，而DNA分子生物學(xué)鑒定方法可以很好的避免主觀性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，因此DNA分子生物學(xué)鑒定作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行中藥鑒別，該方法更為準(zhǔn)確可靠，非常適合于易混淆品種、近緣種的鑒定，而紫堇屬藥材在西藏分布廣泛，種類繁多，應(yīng)用DNA分子鑒定方法可以更好，更準(zhǔn)確的對黃堇類藏藥進(jìn)行鑒定，因此，黃堇類藥材DAN分子生物學(xué)鑒定方法的建立，具有一定的實踐性。

1.材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

本實驗樣品黃堇葉片，于2018年7月采自于西藏嘉黎縣，將采集的葉片保存于放置硅膠干燥顆粒的樣品袋中，備用。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

天根植物DNA提取試劑盒、諾維贊2×Phanta Max Master Mix、Invitrogen瓊脂糖凝膠、100 bp DNA marker、應(yīng)用生物系統(tǒng)PCR儀、電泳儀（DYY-6C 型）、凝膠成像儀（Tanon-2500 型）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取

使用液氮將植物葉片速凍，用研缽將凍好的葉片研碎至粉末狀，然后按照植物DNA提取試劑盒的步驟，進(jìn)行葉片DNA 的提取，設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 ITS2 和 psbA-trnH 基因片段的擴(kuò)增

（1）引物的合成。ITS2基因片段擴(kuò)增引物參考《中國植物志》[4]，ITS2 序列擴(kuò)增引物：ITS2F：ATGCGATA CTTGGTGTGAAT，ITS2R：GACGCTTCTCCAGACTAC AAT；psbA-trnH基因片段擴(kuò)增引物采用《中華人民共和國藥典》（2015版）4部，中藥材 DNA 條形碼分子鑒定中的通用引物，psbA-trnH 擴(kuò)增引物：psbAF：GTTATG CATGAACGTAATGCTC，trnHR ：CGCGCATGGTGGAT TCACAATCC。

（2）PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25μl，其中2×Phanta Max Master Mix，上下游引物各 1.0μl，模板 1.0μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃10min，變性 94℃30s，退火 56℃(ITS2基因)/52℃(psbA-trnH基因) 30s，延伸 72℃30s，35 個循環(huán)，再延伸 72℃ 10min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

取3ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，使用100bp DNA marker凝膠成像儀觀察DNA片段并拍照，以便了解PCR擴(kuò)增情況。

1.2.4 ITS2 和 trnA-psbH 基因序列的分析

用 Chromos 軟件觀察所測序峰圖質(zhì)量，之后將序列導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站進(jìn)行物種鑒定。

2.實驗結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

按照DNA提取試劑盒的說明方法步驟對樣品DNA進(jìn)行提取，分別提取了同一樣品植株根、莖、葉3個部位的DNA，均可提取到，提取到的DNA總長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于500bp。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用ITS2 和 psbA-trnH 兩條引物對目標(biāo)條帶進(jìn)行擴(kuò)增，通過凝膠電泳跑帶，紫外顯像，結(jié)果顯示，利用ITS2和psbA-trnH兩條引物均可擴(kuò)增出條帶，其中引物ITS2擴(kuò)增出的條帶比引物psbA-trnH擴(kuò)增出的條帶要短些。ITS2擴(kuò)增出的條帶長約440bp～460bp，psbA-trnH擴(kuò)增出的條帶長約495bp～550bp。

2.3 序列比對

將擴(kuò)增出的序列，ITS2 和psbA-trnH 分別導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行比對，比對結(jié)果見表1。

表1 ITS2 和psbA-trnH比對結(jié)果

從比對結(jié)果中分別選擇4條相似度較高的序列，用BioEdit軟件進(jìn)行比較分析，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITS2 條帶中，位點(diǎn)50至位點(diǎn)140，位點(diǎn)240至位點(diǎn)295之間，差異較明顯，其他位點(diǎn)差異不明顯，見圖1。綜合比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS2 條帶位點(diǎn)變異較大，與采集到的標(biāo)本基本符合；而擴(kuò)展出的葉綠體中的psbA-trnH條帶，在位點(diǎn)310至位點(diǎn)338，以及位點(diǎn)470附近，存在差異，其他位點(diǎn)差異不明顯，見圖2。葉綠體中的psbA-trnH條帶分析結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，與采集到的標(biāo)本存在差異。

圖1 用BioEdit軟件對ITS2條帶分析結(jié)果截圖

圖2 用BioEdit軟件對psbA-trnH條帶分析結(jié)果截圖

3.結(jié)語

通過兩對引物對ITS2 和 psbA-trnH 條帶進(jìn)行擴(kuò)增，均可得出擴(kuò)增結(jié)果，且擴(kuò)增出的條帶通過凝膠電泳顯像，條帶清晰，均可進(jìn)行測序。將測序結(jié)果導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對，可獲得比對結(jié)果，但將比對結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，ITS2條帶位點(diǎn)變異量較大，且比對獲得的物種種類與采樣獲得的種類相一致，而psbA-trnH條帶位點(diǎn)變異量較少，比對結(jié)果與樣本鑒定結(jié)果存在差異，或許作者所采集到的物種，還沒有其他研究者進(jìn)行psbA-trnH 條帶的擴(kuò)增并上傳至NVBI網(wǎng)站，所以得出的結(jié)果與采集的樣品存在差異。但整體來講，通過ITS2 和psbA-trnH 條帶的擴(kuò)增，對紫堇屬植物中的黃堇類植物的鑒定具有一定的實踐指導(dǎo)意義。