陰極電勢對微生物電合成系統還原CO2合成有機物性能的影響

柳 焜，王 黎，胡 寧，陳小進，廖夢根

（武漢科技大學 環境污染綠色控制與修復技術研究中心，湖北 武漢 430081）

隨著化石能源的燃燒，自然界中CO2的含量呈現逐年上升的趨勢。由于在熱力學上的穩定性和動力學上的惰性，CO2很難與其他物質發生反應［1］。利用微生物電合成系統（Microbial Electrosynthesis System，簡稱MES）還原CO2是近幾年興起的一種電化學技術［2］。MES可以利用產電微生物電化學氧化還原反應的聯合作用減少CO2轉化為增值化學品所需的熱力學能量，實現廢棄物向可利用的化學物質的轉換［3-4］。

MES合成有機物的性能受到多種因素的影響，主要包括陰極材料、陰極微生物、陰極電勢、質子交換膜等。祁家欣等［5］利用羥基改性碳布電極使乙酸的產量提高了243%。BATLLEVILANOVA等［6］利用巨球型菌（Megasphaerasp.）通過鏈延長的方式將乙酸合成丁酸。XIANG等［7］采用雙極膜取代質子交換膜，與使用質子交換膜相比，乙酸產量提高了238%，并且在陰極的醋桿菌（Acetobacteriumsp.）相對豐度比之前高。而陰極電勢對MES中還原CO2合成有機物的過程也有重要的影響。例如JIANG等［8］發現在穩定的陰極電勢下，MES能在固定CO2的同時合成乙酸等有機物，外加電勢對MES中產物的類型和組成及細胞的代謝有著極其重要的影響。這主要體現在過高的電極電勢或者過低的電極電勢會對電化學功能微生物產生負面的影響，并會導致電化學反應體系中功能菌生長代謝的酶減少，無法進行物質合成和能量代謝，甚至導致細胞死亡。但是不同的陰極電勢對MES還原CO2合成有機物的能力的影響規律還缺乏較為全面的認識。

本工作通過調節陰極電勢提升MES還原CO2合成有機物的性能，以期為MES的工業化應用提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料及試劑

MES菌種來自武漢市某污水處理廠厭氧池的活性污泥。

所用試劑均為分析純。

0.1 mol/L磷酸緩沖溶液：KH2PO46.8 g/L，NaOH 0.944 g/L，pH 6.0。微生物液體培養液：K2HPO42.18 g/L，KH2PO41.70 g/L，NaHCO32.50g/L，NH4Cl 1.25 g/L，KCl 0.10 g/L，MgCl2·6H2O 1.00 g/L，NaCl 0.80 g/L，CaCl2·2H2O 0.30 g/L，L-半胱氨酸 0.50 g/L，微量元素溶液10 mL/L，維生素溶液10 mL/L，pH 6.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 MES的建立

MES采用3電極體系H型雙室反應器，兩室容積均為500 mL，陰陽兩極室之間通過陽離子交換膜（厚度為0.16～0.23 mm，北京廷潤膜技術開發股份有限公司）隔開。陽離子交換膜在使用前置于0.5 mol/L的NaCl溶液中至少浸泡24 h，然后用去離子水清洗干凈，使得陽離子交換膜充分水化和膨脹。用直徑0.5 mm的鈦絲作導線，陰極以碳氈（8.00 cm×8.00 cm×0.10 cm）作為工作電極，陽極以鈦板（8.00 cm×4.00 cm×0.05 cm）作為對電極，參比電極采用Ag/AgCl電極（218型，上海雷磁儀器有限公司，相對標準氫電極電勢為+0.197 V）并置于陰極電解室中。陽極電解液為磷酸緩沖溶液，陰極電解液為微生物液體培養液，培養溫度（37±1）℃。在本實驗中，所有的電勢數據均相對于Ag/AgCl參比電極，MES輸出電壓、電流監測均采用電化學工作站（CHI660E型，上海辰華儀器有限公司）。

1.2.2 實驗過程

活性污泥先置于干燥處進行厭氧暴曬，以除去霉菌等不良微生物。取20 mL處理后活性污泥接入電化學反應器陰極室，同時加入480 mL液體培養基，在陽極室中加入500 mL磷酸緩沖液（pH=6.0），通過向陰極室中加入2-溴乙基磺酸鈉抑制污泥中產甲烷菌的活性［9］。陰極電極的電勢設為-0.70 V（相對于Ag/AgCl），在陰極室的底部通入CO2（純度＞99.999%）進行微孔曝氣（曝氣流量20 mL/min，曝氣時間40 min，靜止時間4 h），其中陽極進行沒有微生物的氧化反應，陰極進行有電化學功能菌的還原反應?；钚晕勰嗟鸟Z化周期為8 d，待每個周期結束后，檢測陰極液中有機物的濃度并置換出75%的陰極液開始下一個周期，直到陰極檢測到的有機物濃度與上一周期完全相同時，表明電化學功能菌馴化完成，微生物掛膜成功。然后利用電化學工作站分別設置5組實驗組，陰極電勢分別設為-0.40，-0.50，-0.60，-0.70，-0.80 V，另外一組不施加外電勢（電勢為0 V）作為對照組。接通電源，內置Ag/AgCl參比電極，反應裝置連續運行24 h，對反應的產物進行檢測分析。

1.3 分析方法

1.3.1 微生物形態的SEM表征

用無菌鑷子從陰極碳氈上取5 mm×5 mm大小的薄片，用2.5%（w）戊二醛固定液固定2.5 h；用磷酸緩沖溶液清洗3次，每次10 min；再分別利用30%，50%，70%，85%，95%（φ）的乙醇各脫水一次，每次15 min，100%濃度的乙醇脫水2次，每次20 min；最后用乙酸異戊酯置換2次，每次15 min。試樣干燥后用離子濺射儀（GVC2000型，上海禾早電子科技有限公司）噴金，采用掃描電子顯微鏡（XL 30 TMP型，荷蘭Philips公司）觀察陰極電極上微生物的形態。

1.3.2 細菌PCR高通量測序

反應結束后，分別收集不同電勢下陰極碳氈上的混合菌體，混合細菌的DNA提取采用細菌DNA提取盒（武漢華大基因有限公司）進行。16S PCR擴增采用通用引物的序列：正向引物采用F1：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物采用R1：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。通過Illumina Mise平臺進行高通量測序。

1.3.3 合成有機物的高效液相色譜分析

采用高效液相色譜儀（U3000型，美國戴安公司），0.45 μm濾膜過濾，微量進樣器進樣，進樣量20 μL，入C18反相檢測柱，流動相為0.01 mol/L NaH2PO4溶液（pH為3.0），流量0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm。

1.3.4 電化學分析

MES穩定運行一段時間后，陽極連接對電極，陰極連接工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，利用電化學工作站對MES進行循環伏安（CV）掃描。CV掃描參數：掃描電勢范圍-1.0～0.8 V，掃描頻率0.005 V/s。

反應結束后，通過陰極液中各產物的最終積累量計算MES的總庫倫效率，計算方法參考文獻［10］。庫倫效率是指微生物在陰極上捕獲電子轉化為有機物的效率。

2 結果與討論

2.1 MES還原CO2合成有機物分析

在MES中，微生物在電流的驅動下還原CO2合成甲酸和乙酸。合成產物甲酸（a）、乙酸（b）積累量隨時間的變化見圖1。

由圖1a可見：在反應的前18 h，隨著反應的進行，甲酸積累量的上升趨勢十分明顯，隨后上升速率降低直至趨于穩定；當陰極電勢從-0.40 V降至-0.50 V時，甲酸的積累量相差不大，可能的原因是較小的電勢差對微生物代謝影響較??；在陰極電勢為-0.70 V時，甲酸的積累量最大，反應24 h時達到1.554 mmol/L，其產生速率約為0.065 mmol/（L·h）；當陰極電勢進一步降至-0.80 V時，反應24 h時的甲酸的積累量降為1.467 mmol/L。

圖1b可見：隨著反應的進行，乙酸的積累量在整體上隨著反應的進行呈現出不斷上升的趨勢；當陰極電勢在-0.70 V時，反應24 h時的乙酸的積累量最大，為2.754 mmol/L。

圖1 合成產物甲酸（a）、乙酸（b）積累量隨反應時間的變化

2.2 總庫倫效率分析

庫倫效率能夠反映MES中微生物捕獲電子以及吸收電子催化還原底物合成轉化相應產物的能力［11］。陰極電勢對MES庫倫效率的影響見圖2。由圖2可見：整個系統的總庫倫效率變化范圍在41.07%～81.42%之間，其中有機物的庫倫效率在39.23%～75.80%之間；陰極電勢為-0.70 V時，系統的總庫倫效率最大，為81.42%，此條件下乙酸的庫倫效率為66.44%，比BAJRACHARYA等［12］報道的乙酸庫倫效率（40%）要高；總庫倫效率最小值為-0.40 V時的41.07%，與NEVIN等［13］的研究結果相比，本實驗結果稍低；陰極電勢為-0.80 V時，總庫倫效率為77.09%；陰極電勢為-0.50～-0.60 V時，總庫倫效率為42.91%～56.60%。

圖2 陰極電勢對MES庫倫效率的影響

2.3 電化學分析

不同陰極電勢下反應后MES的CV曲線見圖3。

圖3 不同陰極電勢下反應后MES的CV曲線

由圖3可見：各陰極電勢條件下CV曲線中的電流值均比對照組的要大，表明電化學功能微生物在陰極發生了還原反應；在陰極電勢為-0.70 V時，電流值最大，電流密度最大，且在-0.62 V附近出現了還原峰，該還原峰出現的位置與之前HAWKINS等［14］報道的結果相似；隨著陰極電勢的改變，MES陰極還原CO2的還原峰出現的位置差別不大，表明陰極電勢的差異對MES還原CO2的還原電位幾乎沒有影響；但是不同陰極電勢下CV曲線對應的曲線面積相差較大，通過CV計算反應完成后電極的電容效應發現，陰極電勢-0.80，-0.70，-0.60，-0.50，-0.40 V下的電容分別為0.542，0.673，0.439，0.374，0.288 F，與對照組（0.065 F）相比，外加電勢組的電容提高了約3.4～9.4倍，這說明施加外加電勢后，陰極電容有了極大的提高。對比不同陰極電勢條件下的陰極電容發現，在-0.70 V的條件下電勢電容最大。電極電容越大，表明生物陰極比表面積越大，陰極生物的活性表面積得到了提升，從而提高了MES的合成轉化效率。

2.4 SEM結果分析

MES陰極表面的SEM照片見圖4。由圖4可見：MES陰極碳氈纖維表面不同程度附著微生物，微生物緊密吸附在碳氈纖維的表面，說明電極材料具有良好的生物親和性。

圖4 MES陰極表面的SEM照片

2.5 微生物菌群高通量測序分析

陰極生物膜細菌在屬水平上的分布情況見圖5。由圖5可見：醋桿菌（Acetobacteriumsp.）、假絲酵母菌（Candidasp. S）、地桿菌（Geobactersp.）等在各電勢條件下豐度均相對較高，為優勢菌群；未馴化污泥中甲烷菌（Methanothrixsp.）的豐度為13%，其次是變形桿菌（Proteussp.）11%、醋桿菌10%、大腸桿菌（Escherichiasp.）10%、假絲酵母菌8%；而在不同電勢強度的實驗組中均未檢測到甲烷菌，這是因為在馴化之前加入了甲烷抑制劑，抑制了與其他菌種競爭電子的產甲烷菌的生長，這樣能使反應向著更益于合成有機酸的方向進行［15］。醋桿菌是一種產乙酸菌，它可以利用H2和CO2生成乙酸［16］。對比外加電勢和無電勢的MES發現，在外加電勢條件下假絲酵母菌生長更為旺盛，其豐度在不同電勢條件下均有明顯提升，可能的原因是假絲酵母菌可以捕捉電子，一方面用于自身細胞生長代謝，另一方面消耗底物合成相應產物。

圖5 陰極生物膜細菌在屬水平上的分布情況

由圖5還可見：陰極電勢為-0.40 V的條件下，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）的豐度為13%，假絲酵母菌（Candidasp. S）的豐度為12%，地桿菌（Geobactersp.）的豐度相對較低，只有7%；隨著陰極電勢的降低，這3種優勢菌在屬水平上的豐度均有明顯提高，在電勢條件為-0.70 V時，3種優勢菌豐度之和相對整個菌群占比最大，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）為33%、假絲酵母菌（Candidasp. S）為23%、地桿菌（Geobactersp.）為14%，在此條件下MES中有機酸的積累量最多，可能的原因是這些細菌可以通過特殊途徑建立互利共生的關系，營造出一種共養的環境，微生物之間的協同作用使得混合菌群能在電勢的作用下合成有機酸，這與之前的報道一致［17］；而在-0.80 V條件下，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）的豐度為28%、假絲酵母菌（Candidasp. S）為22%、地桿菌（Geobactersp.）為12%，相比-0.70 V條件下略有降低，這表明優勢菌的最適電勢為-0.70 V，一旦超過最適宜的電勢條件反而不利于微生物的生長?？刂坪眉毦L的最適電勢，是提高MES還原CO2合成有機物的關鍵。

3 結論

a）采用3電極體系H型雙室反應器建立MES，還原CO2合成有機物。陰極電勢從-0.40 V降至-0.70 V時，甲酸積累量從0.774 mmol/L增加到1.554 mmol/L；當降至-0.80 V時，甲酸積累量降為1.467 mmol/L。電勢為-0.70 V時，乙酸積累量最大，為2.754 mmol/L。

b）整個系統陰極的總庫倫效率變化范圍為41.07%～81.42%，其中有機酸的庫倫效率為39.23%～75.80%。陰極電勢為-0.70 V時總庫倫效率最大，為81.42%；-0.40 V時最小，為41.07%。

c）在陰極電勢為-0.7 0 V時，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）、假絲酵母菌（Candidasp. S）、地桿菌（Geobactersp.）3種菌在陰極生物膜上占比最大，為優勢菌種，豐度分別為33%，23%，14%。