雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒種鑒定

王丹丹

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150227）

雞傳染性支氣管炎（IB）是由冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起雞的一種高度接觸性傳染病，是嚴重影響我國養雞業的主要疫病之一。為了防治IB，除了用嚴格的生物安全措施外，疫苗免疫接種已成為防治IB不可缺少的手段之一。IB常規疫苗分為弱毒疫苗和滅活疫苗，是養雞生產中不可缺少的。IBV血清型眾多，各血清型之間沒有或僅有部分交叉免疫保護。研究表明，我國目前流行的IBV血清型主要屬于馬薩諸塞型（Massachusetts）[1]。M41株是馬薩諸塞型的標準毒株，該毒株以繁殖滴度高、免疫原性好、特異性強等優點在世界范圍內被廣泛使用[2]。在進行IB 滅活疫苗研究時，選用M41作為IB滅活疫苗的種毒株。為此，研究對M41株進行了鑒定和傳代研究，并建立M41株種子庫。

1 材料與方法

1.1 病毒

IBV M41株購自中國獸藥監察所。

1.2 IBV M41的HA抗原和陽性血清

IBV（M41 株）HA抗原購自荷蘭GD 公司。抗血清由本實驗室自制，小量分裝，-70 ℃保存，HI≥1∶256。

1.3 SPF雞和SPF雞胚

SPF雞和SPF雞胚來自哈藥集團生物疫苗有限公司SPF雞場。

1.4 毒種的復壯和傳代

將毒種作103倍稀釋，接種10 日齡的SPF 雞胚，每個胚尿囊腔接種0.1 mL。接種后將30 h前死亡的雞胚剔除，收取30～48 h死胚和48 h活胚尿囊液，記為E0 代，低溫保存備用。將M41 株毒種用SPF胚連續傳12代，分別記作E1～E12。

1.5 病毒含量（EID50）

將E1、E5、E9和E12代次的毒種分別作10倍系列稀釋，取10-4～10-85個稀釋度，每個稀釋度接種5個10日齡的SPF雞胚，每胚接種0.1 mL。剔除24 h 前死亡的雞胚，觀察144 h，計算病毒的EID50。接種后24～144 h，雞胚死亡或存活雞胚的胎兒出現失水、蜷縮、發育矮小等特異癥狀判為感染。

1.6 毒力

1.6.1 對雞胚毒力的測定

將E1、E5、E9 和E12 代次毒種用滅菌生理鹽水作1 000 倍稀釋，尿囊腔內接種10 日齡SPF 雞胚10 個，每個0.1 mL，置37 ℃繼續孵化，照胚1～2次·d-1，記錄24～144 h內死亡胚的數量和胎兒病變情況。

1.6.2 對SPF雞毒力的測定

將E1、E5、E9和E12代次的毒種分別作10倍稀釋，經氣管接種10只10日齡以內的SPF雞，每只0.1 mL，觀察10 d，記錄雞的臨床癥狀，在攻毒后第10天，剖殺雞，取氣管，制氣管環，在顯微鏡下觀察環纖毛破壞情況，對個別氣管環作病理切片。

1.7 特異性

將E1、E5、E9 和E12 代次毒種用滅菌PBS 稀釋1 000 倍，分別與10 倍稀釋的抗IBV、NDV、AIV和EDSV特異血清中和，在室溫作用1 h，接種10 日齡SPF 雞胚各10 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃繼續孵化，觀察到144 h，記錄24～144 h 內死亡胚的數量和胎兒病變情況，出現死亡或胎兒病變視為雞胚感染IBV。

1.8 免疫原性

用甲醛滅活E1、E5、E9 和E12 代次病毒，并分別與油佐劑按1∶3比例乳化，制成滅活疫苗，接種4 周齡的SPF 雞（2 周齡時滴鼻接種IBV H120 疫苗），免疫4周后測定血清的HI抗體。

1.9 IBV分離株對M41陽性血清的反應性

將9 株來自5 個不同地區的IBV 分離株尿囊液用滅菌PBS作1∶1 000稀釋，與等量的10倍稀釋的M41 株特異抗血清混合，室溫作用1 h，然后每個毒株-血清混合物接種到10個雞胚尿囊液中，每胚接種0.1 mL，同時設SPF血清作對照。接種后，每天照胚2 次，隨時取出死亡的雞胚，孵化144 h，取出全部雞胚。對每個雞胚收獲尿囊液，用RT-PCR 方法檢測尿囊液中是否含有IBV 病毒（具體方法見附錄2）。RT-PCR結果陽性的雞胚判為感染，統計雞胚感染情況。

1.10 濕毒種保存期

將M41株E1、E5和E9代次的SPF雞胚尿囊液毒分成數等份，分別存放于-70 ℃；病毒凍干后放-20 ℃冰箱內。在不同時間測定病毒的EID50，每次設3個重復。

2 試驗結果

2.1 毒種的復壯和繼代

M41 株凍干毒種在10 日齡SPF 雞胚上復壯，收獲的胚液計為E0 代毒，然后將E0 代次毒在10日齡的SPF 雞胚繼代12 次，得到E1～E12 代次毒，小量分裝，-70 ℃保存備用。

2.2 病毒含量（EID50）

病毒含量（EID50）結果見表1。

表1 M41株各代次毒種EID50測定

由表1 可知，E1～E12 代次M41 株的易感雞胚尿囊液的EID50為10-6.1·0.1 mL-1～10-6.3·0.1 mL-1，沒有明顯改變。

2.3 毒力

2.3.1 對雞胚毒力

各代次毒種對雞胚毒力的測定結果見表2。

由表2 可知，E1～E12 代次病毒在接種雞胚后的24～144 h，可以致50%的雞胚死亡。早期死亡的雞胚胚體發紅，有尿酸鹽沉積；后期胚體矮小、蜷縮，多數有尿酸鹽沉積，但隨著傳代代次的增加，對SPF雞胚毒力有下降的趨勢。說明各代次病毒對雞胚具有一定的致病力，但致病力有下降的趨勢。

2.3.2 對SPF雞毒力

各代次毒種對SPF 雞毒力的測定結果見表3，呼吸道癥狀見圖1。

表2 各代次毒種對雞胚毒力的測定

表3 各代次毒種對SPF雞毒力的測定

圖1 呼吸道癥狀

由表3 和圖1 可知，給SPF 雞接種不同代次的M41株后，只有少數SPF雞出現程度不同的呼吸道癥狀；但氣管環試驗表明，接種不同代次M41 株病毒后，SPF 雞的氣管纖毛都受到程度相近的破壞，這表明，各代次的M41株病毒對SPF雞具有一定的毒力，隨著傳代次數的增加（E1～E12），毒力沒有發生明顯的改變。

2.4 特異性

各代次毒種特異性的測定結果見表4。

由表4可知，各代次病毒能被IBV特異血清中和，表現為接種雞胚后，100%雞胚發育正常，說明沒有被IBV感染；病毒不能被NDV、AIV（H9）和EDSV 特異血清中和，表現為接種雞胚后100%的雞胚發育矮小，說明被IBV感染。

表4 各代次毒種特異性的測定

2.5 免疫原性

不同代次的M41 株病毒免疫原性試驗結果見表5。

由表5可知，各代次病毒制成的滅活疫苗免疫SPF 雞后都能產生較高的HI 抗體，這表明各代次病毒仍然具有很好的免疫原性。

表5 不同代次的M41株病毒免疫原性試驗

2.6 IBV分離株與抗M41陽性血清中和試驗

IBV 分離株與M41 陽性血清中和試驗結果見表6。由表6可知，M41株的特異陽性血清可全部或部分中和5個不同地區（河南省、山東省、河北省、黑龍江省、北京市）分離的9 株IBV 中的6 株（SD、HN1、HN2、HB1、HL1、HL2），表現為與相應陰性血清對照組比較，這6株病毒與M41特異陽性血清作用后，無雞胚感染或感染IBV的雞胚數量明顯減少；而與對照血清作用的病毒株可使100%雞胚感染。

表6 IBV分離株與M41陽性血清中和試驗

2.7 保存期

M41株毒種保存期的測定結果見表7。

由表7 可知，各代次病毒濕毒存放在-70 ℃條件下，經過24 個月，病毒含量沒有顯著變化；凍干毒存放在-20 ℃條件下，經過42個月，病毒含量沒有顯著變化。

表7 M41株毒種保存期的測定

2.8 種子庫

根據2.1～2.7的結果，將E0代次病毒傳代至12代，M41 株毒種的特性沒有發生明顯的變化，因此，將M41 株E0 代次病毒作為原始種子，基礎種子的代次范圍定為E1～E5代，生產用毒種的代次控制在基礎種子基礎上傳代不超過3代，即控制在E9代以內。分別建立了M41株病毒的原始種子庫、基礎種子庫和生產種子庫，以便進行M41株病毒滅活疫苗的研究和生產。

3 結 論

IBV的M41株具有免疫原性好、特異性強和繁殖滴度高等優點；經過繼代，在E12代次以內，病毒的各種生物學特性沒有明顯的改變，說明該毒株生物特性穩定。各代次IBV M41 株濕毒在-70 ℃條件下保存24 個月和凍干毒在-20 ℃條件下保存36個月，病毒的效價沒有明顯的改變，可作為毒種進行滅活疫苗的研制。