溫度對紅曲菌以蕎麥為基質固態發酵產色素的影響

熊小倩，諶 雪，高夢祥

（長江大學生命科學學院，湖北荊州 434025）

0 引言

紅曲菌也叫紅曲霉[1]，為真菌門子囊菌綱真子囊菌亞綱紅曲霉屬，在我國已經有1 000多年的歷史，紅曲米是由紅曲菌接種在大米上的發酵產品。紅曲菌發酵能產生對人體有益的多種代謝產物，如麥角甾醇能促進肌體對Ca，P的吸收，利于骨骼的生長[2-3]；γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA） 具有降低血壓、鎮靜安神、促進睡眠、增強記憶力等功能[4]。其中，洛伐他汀能抑制細胞內膽固醇合成，具有降脂的功效[5]。紅曲色素作為一種天然的食品著色劑，具有抗癌、降血糖、降血脂等多種生理活性，也是我國近年來增長速度最快的天然食用色素，在食品、化妝品、醫藥等多領域具有廣泛的應用前景[6-7]。

蕎麥是蓼科蕎麥屬作物，富含高質量蛋白質，賴氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較其他谷物豐富，也富含黃酮類、植物甾醇、肌醇等功能成分[8]，其中，黃酮類化合物具有降血糖和血脂、抗癌防癌、抗氧化、清除自由基、類雌激素等生理功能，已成為蕎麥研究的又一熱點[9]。

試驗利用蕎麥的營養成分，同時發揮紅曲菌的功能，制備出兼備二者功能的產品為目的，研究發酵溫度對固態發酵紅曲蕎麥品質的影響，測定紅曲色素的產量和黃酮含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紫色紅曲菌（Monascus pupureus），長江大學生命科學學院實驗室提供。

1.1.2 培養基

（1） 察氏酵母提取粉瓊脂培養基（CYA）。硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，酵母浸膏5 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

（2）蕎麥培養基。根據發酵條件加入20 g蕎麥和9 mL去離子水，于121℃下高溫高壓滅菌30 min，冷卻。

1.1.3 主要藥品與試劑

乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯乙酸，以上均為分析純；甜蕎麥、蘆丁標準品、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、酵母浸膏、蔗糖、瓊脂。

1.1.4 試驗設備與儀器

分析天平、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、離心機、恒溫培養箱、水浴鍋、紫外可見分光光度計、電熱鼓風干燥箱、粉碎機、超聲波清洗機、顯微鏡等。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲蕎麥的發酵制備

（1）紅曲菌的培養。超凈工作臺紫外殺菌30 min，接種環先高溫高壓滅菌；采用70%左右酒精進行手部殺菌；用滅菌后的鐵環刮取適量紅曲菌涂抹于CYA培養基上，接種環、紅曲菌種瓶口和需要接種的培養基瓶瓶口在使用前和使用后都需要在酒精燈灼燒滅菌。接種后，將培養基放置在恒溫培養箱中，于30℃下培養7 d。

（2） 孢子懸液的制備。超凈工作臺紫外殺菌30min，有玻璃珠的錐形瓶、過濾紙、漏斗、裝有去離子水的錐形瓶等進行高溫高壓滅菌；采用70%左右酒精消毒，無菌條件下，將已長好的菌株用無菌水沖洗，刮下來，過濾后轉入裝有玻璃珠的100 mL錐形瓶中，振蕩并搖勻。無菌條件下，取50μL孢子液于2 mL離心管；從離心管中取10μL，用血球計數板在顯微鏡下數孢子，平行數3組。

（3）發酵培養。稱取20 g蕎麥于錐形瓶中，加入9 mL蒸餾水，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌30 min，取出冷卻；在超凈工作臺進行，無菌操作，將1.2 mL孢子液即4.8×107個孢子接種到蕎麥培養基中，振蕩，分別置于不同溫度（26，28，30，32，34℃）條件下恒溫培養12 d；分別測定時間為2，4，6，8，10，12 d的發酵樣品中色價、生物量和黃酮含量，平行做3組。

1.2.2 生物量的測定

將紅曲蕎麥烘干后，取1.0 g干燥培養物，適當粉碎后，取紅曲蕎麥粉0.2 g于50 mL離心管中，加入5%三氯乙酸25 mL，于80℃水浴條件下加熱25 min，期間不斷攪拌，冰水浴冷卻，以轉速8 000 r/min于4℃條件下離心15 min。以未發酵的固態培養基作空白對照。

在波長260 nm處測定提取液的吸光度，由所測OD值對照純菌體與核酸紫外吸收曲線關系，換算成菌體生物量[10]；其方程為Y=5.882X+0.041 5，相關系數R2=0.993，其擬合效果較好，因此該標準曲線可用。

1.2.3 總黃酮的測定

取2 g紅曲蕎麥，烘干后適當粉碎，將紅曲蕎麥粉和70%乙醇以料液比1∶40進行超聲波萃取。超聲清洗機在50℃，100%功率條件下超聲清洗40 min，過濾后棄去初濾液。取1 mL濾液置于25 mL容量瓶，加入30%乙醇12.5 mL，再加入質量濃度48 g/L亞硝酸鈉0.7 mL，搖勻，靜置5 min；再加入質量濃度91 g/L硝酸鋁0.7 mL，搖勻，靜置6 min，最后加濃度1 mol/L氫氧化鈉5 mL，定容至25 mL，搖勻，靜置10 min。以未加待測液的溶液作對照，采用721型紫外分光光度計于波長510 nm處測定OD值，可得到以蘆丁為標樣的總黃酮含量[11]。

繪制蘆丁標準曲線時，準確稱取0.013 2 mg蘆丁標準品于50 mL容量瓶溶解，30%乙醇定容至50 mL。分別吸取1，2，4，6，8 mL的0.263 mg/mL蘆丁標準溶液于25 mL容量瓶中，加入30%乙醇12.5 mL，加入48 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL，5 min后再加入91 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，6 min后，加入濃度1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，定容放置10 min，以未加蘆丁標準溶液的樣品為空白，于波長510 nm處測定其吸光度。以蘆丁質量濃度為縱坐標、吸光度為橫坐標，繪制標準曲線[12]。其方程為Y=4.441 1X-0.002 9，相關系數R2=0.999，其擬合效果較好，因此該標準曲線可用。試驗測得原始蕎麥吸光度為0.069，由標準曲線可得原始蕎麥中總黃酮含量為3.04±0.15 mg/g。

1.2.4 色價的測定

取紅曲霉三角瓶培養的紅曲蕎麥2 g，干燥后適當粉碎，將紅曲蕎麥粉和75%乙醇以料液比1∶6置于50 mL離心管內，在60℃恒溫水浴鍋加熱浸提1 h，不斷攪拌，冷卻至室溫，以轉速1 300 r/min離心5 min，取上清液稀釋一定倍數，根據顏色適當稀釋，采用紫外分光光度計測定波長410，465，500 nm處的吸光度，再乘以稀釋倍數，即得到黃、橙、紅色素色價[13]。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中溫度對紅曲生物量的影響

發酵過程中溫度對紅曲生物量的影響見圖1。

圖1 發酵過程中溫度對紅曲生物量的影響

從圖1可以看出，在發酵的前6 d，生物量隨著發酵溫度的升高而增大；6 d之后，30℃條件下生長量增長最快。到發酵結束的第12天時，生物量從高到低對應的發酵溫度為30，32，28，34，26℃，即呈現出以30℃為峰值的拋物線規律。這一規律與溫度影響微生物生長的普遍規律一致。這是由于生長代謝和繁殖都有酶的參加。根據酶促反應的動力學來看，溫度升高，反應速度加快，呼吸強度增加，最終導致細胞生長繁殖加快。但隨著溫度的上升，酶失活的速度也越快，使衰老提前、發酵周期縮短，對發酵生產產生不利影響。

2.2 發酵過程中溫度對紅曲菌產色素的影響

紅曲菌在以蕎麥為基質固態發酵過程中，對溫度紅曲菌代謝生產黃、橙、紅色素的影響。

發酵過程中溫度對紅曲黃色素的影響見圖2，發酵過程中溫度對紅曲橙色素的影響見圖3，發酵過程中溫度對紅曲紅色素的影響圖4。

圖2 發酵過程中溫度對紅曲黃色素的影響

圖3 發酵過程中溫度對紅曲橙色素的影響

圖4 發酵過程中溫度對紅曲紅色素的影響

由圖2～圖4可知，黃、橙、紅色素的變化趨勢一致，都呈現出隨著發酵時間的延長，產量逐漸升高。而且表現出發酵4 d后產生色素，3種色素的色價在30℃條件下都增長最快。結合生物量隨溫度的變化規律，發酵溫度的控制策略采取在發酵的0～4 d于34℃下培養，發酵4～12 d進行30℃的培養。

2.3 發酵過程中溫度對蕎麥基質中黃酮含量的影響

發酵過程中溫度對蕎麥基質中黃酮含量的影響見圖5。

圖5 發酵過程中溫度對蕎麥基質中黃酮含量的影響

由圖5可知，蕎麥基質的黃酮含量總體變化不顯著。在各溫度下均呈現出相似的規律，發酵后期黃酮含量略有下降。可能是紅曲菌以蕎麥中包括黃酮在內的其他成分為養分所導致。

3 結論

試驗以蕎麥為紅曲菌的固態發酵基質，以紅曲色素為試驗指標，探討了發酵溫度對紅曲蕎麥中紅曲色素及總黃酮類物質的影響規律，為開發具有紅曲色素活性功能的蕎麥提供了一條新思路。