靈芝孢子油對(duì)老齡小鼠抗氧化能力的影響

趙雅欣，郭 豫，胡 芳，肖勁東

（1.北京聯(lián)合大學(xué)功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，北京 100191；2.北京至元世恒醫(yī)藥研究中心，北京 100088）

0 引言

靈芝孢子油提取自靈芝孢子，集靈芝精華，富含靈芝孢子的有效成分，易被人體吸收利用，其保健功效成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-3]。現(xiàn)代研究表明，靈芝孢子油富含三萜類(lèi)化合物、甾醇和不飽和脂肪酸，在神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、降血脂等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但關(guān)于靈芝孢子油抗氧化作用的研究尚且不多[4-5]。此外，相關(guān)研究多未表明所用靈芝孢子油的來(lái)源，而提取方式也會(huì)影響靈芝孢子油的有效成分及功效。有研究人員通過(guò)對(duì)靈芝孢子油提取方式的研究，發(fā)現(xiàn)超臨界CO2流體萃取技術(shù)在保證安全和提取率的同時(shí)，能夠最大限度地保留靈芝孢子的活性成分[6-8]。因此，試驗(yàn)利用老齡小鼠模型，采用現(xiàn)代藥理學(xué)方法，明確使用超臨界CO2流體萃取技術(shù)進(jìn)行受試物提取，考查了靈芝孢子油的體內(nèi)抗氧化作用，旨在為靈芝孢子油在抗氧化方面的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

靈芝孢子油，淺黃色液體，鹽城市大豐葆康源生物科技有限公司提供；選用赤芝（Ganoderma lucidum）的破壁靈芝孢子，采用CO2超臨界萃取法提取，三萜含量達(dá)15 g/100 g以上。

1.1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)8月齡KM種雌性小鼠[許可證號(hào)：SCXK-（京）2016-0011]，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；維持飼料[許可證號(hào)：SCXK（京） 2014-0010]，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.1.3 試劑

8-Isoprostane KIA Kit（酶聯(lián)免疫試劑盒），Cayman Chemical Company提供；SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、GSH試劑盒、MDA試劑盒、蛋白質(zhì)羰基試劑盒、雙縮脲蛋白試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 儀器

BS223S型電子天平、BS2202S型電子天平，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司產(chǎn)品，3k15型高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；UV2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；Elx808型酶標(biāo)儀，BioTek美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；SHH.W21.600C型恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與劑量

根據(jù)丙二醛的含量隨機(jī)將小鼠分成3組，每組10只。靈芝孢子油的人體推薦劑量為1.5 g/d（成人體重以60 kg計(jì)），小鼠灌胃劑量按人體推薦劑量的10，30倍設(shè)置，即設(shè)10倍組（250 mg/kgBW）、30倍組（750 mg/kgBW），另設(shè)空白對(duì)照組。

1.2.2 受試物配制及給予

根據(jù)試驗(yàn)劑量，用玉米油稀釋靈芝孢子油至適宜濃度（小鼠灌胃體積為10 mL/kgBW），空白對(duì)照組以玉米油為受試物，灌胃量相同。每日一次經(jīng)口給予，連續(xù)灌胃40 d。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)食藥監(jiān)保化[2012]107號(hào)附件1：抗氧化功能檢驗(yàn)方法，進(jìn)行以下指標(biāo)的測(cè)定，部分方法稍作修改。

（1）小鼠體重的測(cè)定。灌胃前后，分別測(cè)定小鼠體重并記錄。

（2）脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定。取血0.5 mL于室溫下靜置10 min，以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)；采用比色法，嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定血中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量。

小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min。取上清液，用EIA緩沖液稀釋15倍備用；嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定血清中8-表氫氧-異前列腺素（8-Isoprostane）。

（3）蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定。取0.1 g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加入0.9 mL冰的10 mmol/L HEPES緩沖液（pH值7.4），制成10%的勻漿。將勻漿液以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，保留上清液。取100 g/L的硫酸鏈霉素溶液50μL，加入上清液450μL（V/V，1∶9），室溫放置10 min后，以轉(zhuǎn)速11 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)；嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定肝組織中蛋白質(zhì)羰基。

（4）抗氧化酶活力測(cè)定。嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定紅細(xì)胞抽提液中超氧化物歧化酶（SOD）活力；嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定全血谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力。

（5）抗氧化物質(zhì)測(cè)定。取組織0.5 g加生理鹽水4.5 mL充分研磨成細(xì)漿（10%肝勻漿），混勻后取漿液0.5 mL加4%磺基水楊酸0.5 mL混勻，在室溫下以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，取上清液備用。嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定肝組織中還原型谷胱甘肽（GSH） 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)、分析數(shù)據(jù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)全部表示為X±s，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以p＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)前小鼠血清丙二醛含量

給予受試物前小鼠血清MDA含量及給予受試物前后小鼠體重的變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 給予受試物前小鼠血清MDA含量及給予受試物前后小鼠體重的變化情況

由圖1可知，試驗(yàn)前各劑量組老齡小鼠血清丙二醛含量與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性（p＞0.05）。小鼠分組的科學(xué)性直接影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，故選用專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)培育的試驗(yàn)小鼠，并遵循隨機(jī)分組原則，在試驗(yàn)前通過(guò)測(cè)定各組小鼠的血清MDA值來(lái)確定分組的科學(xué)性。由檢測(cè)結(jié)果可知，給予靈芝孢子油前老齡小鼠血清丙二醛含量在各組間較為均衡，符合隨機(jī)分組要求，具有分組科學(xué)性。

2.2 對(duì)小鼠體重的影響

由圖1可知，經(jīng)口給予老齡小鼠靈芝孢子油前及給予靈芝孢子油40 d后體重在各劑量組與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性（p＞0.05）。小鼠體重是小鼠是否健康的一個(gè)最基礎(chǔ)、最重要的衡量指標(biāo)。給予受試物前小鼠體重?zé)o顯著性差異，表明小鼠分組合理；給予受試物后各組小鼠體重?zé)o顯著性差異，說(shuō)明該受試物對(duì)老齡小鼠的體重?zé)o不良影響，可推斷出該受試物不會(huì)對(duì)小鼠健康帶來(lái)不良影響，一定程度上說(shuō)明靈芝孢子油具有較好的食用安全性。

2.3 對(duì)小鼠脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響

靈芝孢子油對(duì)小鼠血清MDA，8-Isoprostane含量的影響見(jiàn)圖2。

圖3 靈芝孢子油對(duì)小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響

圖2 靈芝孢子油對(duì)小鼠血清MDA，8-Isoprostane含量的影響

由圖2可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對(duì)照組比較，高劑量組小鼠血清MDA含量降低，有顯著差異（p＜0.05）；小鼠血清8-Isoprostane含量無(wú)明顯變化（p＞0.05）。血清MDA和8-Isoprostane都是表明小鼠脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的指標(biāo)，但試驗(yàn)中出現(xiàn)了MDA含量降低但8-Isoprostane含量無(wú)明顯變化的情況，即靈芝孢子油在750 mg/kgBW劑量水平能降低老齡小鼠血清中的丙二醛含量，但靈芝孢子油對(duì)小鼠血清8-表氫氧-異前列腺素含量無(wú)顯著影響。這可能與2個(gè)指標(biāo)的敏感性有關(guān)，在灌胃40 d后小鼠血清MDA含量降低，也許更長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)引起小鼠血清8-Isoprostane含量的降低。趙灝等人[9]探討了靈芝孢子油對(duì)大鼠肝纖維化的影響，發(fā)現(xiàn)靈芝孢子油可顯著降低大鼠血清中MDA含量，與研究結(jié)果一致，說(shuō)明靈芝孢子油具有降低體內(nèi)MDA含量的能力。

2.4 對(duì)小鼠蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響

靈芝孢子油對(duì)小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對(duì)照組比較，高劑量組小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量降低，有顯著差異（p＜0.05）。一些氧自由基會(huì)氧化蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)羰基產(chǎn)物的積累；一些自由基甚至?xí)?dǎo)致肽鏈斷裂，破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，同樣會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基。具有羰基的蛋白質(zhì)會(huì)聚集、交聯(lián)，從而失去應(yīng)有的活性，因此蛋白質(zhì)羰基含量是蛋白質(zhì)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。靈芝孢子油能夠降低小鼠肝組織蛋白質(zhì)羰基含量，這與靈芝孢子油較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān)，說(shuō)明其抗氧化作用能夠減少機(jī)體蛋白質(zhì)的氧化。結(jié)果表明，靈芝孢子油在750 mg/kgBW劑量水平能降低老齡小鼠肝組織中的蛋白質(zhì)羰基含量，有助于減緩機(jī)體的過(guò)氧化作用。靈芝孢子油使得老齡小鼠血清中的蛋白質(zhì)羰基的水平顯著降低，可以有效阻止一些自由基對(duì)蛋白質(zhì)的氧化作用；其他文獻(xiàn)中對(duì)靈芝孢子油和蛋白質(zhì)羰基的關(guān)系研究尚少。

2.5 對(duì)小鼠抗氧化酶活力的影響

靈芝孢子油對(duì)小鼠血中SOD和GSH-Px活力的影響見(jiàn)圖4。

圖4 靈芝孢子油對(duì)小鼠血中SOD和GSH-Px活力的影響

由圖4可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對(duì)照組比較，低、高劑量組小鼠血清SOD活力和GSH-Px活力均無(wú)明顯升高（p＞0.05）；即靈芝孢子油對(duì)老齡小鼠的血清過(guò)氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力無(wú)顯著影響。SOD和GSH-Px是2種機(jī)體很重要的抗氧化酶，其活力高低標(biāo)志著機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱，給予靈芝孢子油后老齡小鼠的抗氧化酶活力并未提高，說(shuō)明靈芝孢子油不能通過(guò)提高酶活力的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。胡瞬等人[10]研究了靈芝孢子油對(duì)小鼠衰老模型的抗氧化作用，結(jié)果表明靈芝孢子油可顯著提高衰老小鼠血液中的過(guò)氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶活性。江紅梅等人[11]對(duì)輻射損傷老齡小鼠模型的研究也表明，靈芝孢子油對(duì)小鼠血液紅細(xì)胞的SOD活力有顯著提高的作用。但研究中，靈芝孢子油沒(méi)有顯著提高老齡小鼠的SOD活力，這可能與動(dòng)物模型、灌胃劑量等有關(guān)，胡瞬、江紅梅等人[10-11]選用的最大灌胃劑量均大于研究。

2.6 對(duì)小鼠肝組織還原型谷胱甘肽含量的影響

靈芝孢子油對(duì)小鼠肝組織還原型谷胱甘肽含量的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，經(jīng)口給予老齡小鼠不同劑量的靈芝孢子油40 d后，與對(duì)照組比較，肝組織GSH含量無(wú)明顯升高（p＞0.05）；即靈芝孢子油對(duì)老齡小鼠的肝組織還原型谷胱甘肽含量無(wú)顯著影響。還原型谷胱甘肽是肝組織中重要的抗氧化物質(zhì)，靈芝孢子油未能顯著提高其含量，說(shuō)明靈芝孢子油不能通過(guò)提高肝組織還原型谷胱甘肽含量而間接地起到防止機(jī)體過(guò)氧化的作用。陳體強(qiáng)等人[12]不僅研究了靈芝孢子油中的脂溶性維生素，而且研究了靈芝孢子油的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)靈芝孢子油有明確的抗氧化活性。靈芝孢子油抗氧化的機(jī)理還可以做更進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

靈芝孢子油能顯著降低老齡小鼠的血清MDA含量和肝組織蛋白質(zhì)羰基的水平，說(shuō)明靈芝孢子油能夠減少小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物，具有顯著的抗氧化作用。但是，靈芝孢子油并不能有效提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的活力或含量，這說(shuō)明靈芝孢子油應(yīng)該是直接跟氧自由基等活性氧作用，從而保護(hù)機(jī)體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)不被氧化，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。關(guān)于靈芝孢子油與其抗氧化作用的量效關(guān)系及確切機(jī)制，還有待更進(jìn)一步研究。