星點設計-效應面優化法優選全蝎剛毛顯微特征常數測定條件

王迎夏,楊濤,彭振瑜,張靜偉,劉孟瑜,陳聰慧

(臨沂大學藥學院，山東 臨沂 276000)

全蝎，中藥名，為鉗蝎科動物東亞鉗蝎(ButhusmartensiiKarsch)的干燥體，辛，有毒。具有熄風鎮痙、攻毒散結、通絡止痛之功效。《中國藥典》2015年版收錄性狀：本品頭胸部與前腹部呈扁平長橢圓形，后腹部呈尾狀，皺縮彎曲，完整者體長約6 cm。頭胸部呈綠褐色，前面有1對短小的螯肢和1對較長大的鉗狀腳須，形似蟹螯，背面覆有梯形背腹面有足4對，均為7節，末端各具2爪鉤；前腹部由7節組成，第7節色深，背甲上有5條隆脊線。背面綠褐色，后腹部棕黃色，6節，節上均有縱溝，末節有銳鉤狀毒刺，毒刺下方無距。氣微腥，味咸。全蝎粉末呈淡黃色至棕黃色，微腥。剛毛呈棕黃色，完整或短碎存在，靠近基部呈淡黃白色至白色變化，較平直，近基部稍膨大，毛干具有明顯的直線型縱向紋理。可于光學顯微鏡10倍鏡下觀察，具有生物學穩定特征，易于觀察計數(見圖1)。主產于河南、山東、河北、遼寧等地。

目前國內多采取正交設計或均勻設計法優化顯微常數測定條件[1-4]，這兩種方法多采用線性數學模型，雖有簡便、試驗次數較少等優點，但精度不太高。星點設計是在析因設計的基礎上，加上星點及中心點而形成的試驗設計方法，該法采用非線性數學模型擬合，復相關系數較高，在中心點進行重復性試驗以提高試驗精度，預測值更接近真實值且簡便，試驗次數較少[5-8]。本試驗以顯微常數RSD值為指標，引入星點試驗設計方法，結合效應面法優選全蝎剛毛顯微常數測定條件，旨在優化全蝎剛毛顯微特征常數測定條件的同時，為探討該試驗設計法進一步應用優選全蝎剛毛顯微特征常數測定條件可行性提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ME104萬分之一電子分析天平(深圳市盛美儀器有限公司)；Olympus CX-41生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；KQ3200DV超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；QE-100高速中藥粉碎機(浙江屹立工貿有限公司)。

1.2 材料 甘油、水合氯醛(天津市瑞金特化學品有限公司)均為分析純；試驗用水合氯醛試液均按照《中國藥典》2015年版(一部)附錄配置。

全蝎來源于臨沂市各大藥房，因來源不同各個藥店的全蝎質量均有略微差異。所有試驗樣品經臨沂大學天然藥物化學教研室陳聰慧老師鑒定為全蝎正品。具體來源見表1。

表1 全蝎樣品信息

2 方法與結果

2.1 載玻片試液體積的選擇 精選完整的大小接近的優質全蝎在磨藥器中充分研磨0.5 min，然后過80目篩得到全蝎粉末,根據表3分別精密稱取全蝎粉末9份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL容量瓶，根據表3加入不同量的甘油，最后用水合氯醛試液定容混勻。用移液槍吸取試液滴到載玻片上，用蓋玻片蓋住測出不同條件的試液完全被蓋玻片所覆蓋同時又不溢出時的體積求得平均值。以平均值作為移液槍吸取的體積。經過試驗，選定0.04 mL為每張玻片所用樣品試液的最適體積。

2.2 目篩的篩選 根據分析得到影響顯微常數的3個因素為甘油量、全蝎的質量、目篩的大小，因為星點設計需要的是連續的變量，所以目篩的大小在做星點設計之前需要篩選出來，通過固定其他兩個因素不變，改變目篩的選擇，做預試驗選出需要的目篩。分別稱取過65目篩、80目篩、100目篩的全蝎粉末500 mg加水合氯醛試液少量水飛，移入25 mL容量瓶，加10 mL甘油，用水合氯醛試液定容充分搖勻，分別取0.04 mL進行顯微裝片，每份樣品溶液平行裝片30張，觀察剛毛個數并記錄。測出每份樣品的RSD值，試驗結果見表2，選出目篩為65目。

表2 各目篩混勻度RSD值

2.3 星點設計-效應面優化法條件優化設計 根據文獻報道及顯微常數的測定方法[9-13]，確定顯微常數測定條件的考察因素為全蝎粉末量、甘油量、目篩的大小。由于目篩為非連續變量，回歸處理較困難，結合預試驗結果定為 65目篩，其余因素的水平據預試驗結果而定，全蝎的質量范圍為100～700 mg,甘油的體積范圍為2～10 mL以全蝎剛毛個數的RSD值為考察指標，采用星點設計優化顯微常數測定條件，水平取值為0、±1、±λ，λ=(F)1/4，F為析因設計部分試驗次數，F=k2(k為因素數)或者F=k2×(1/2)(一般5因素以上采用)，因素水平見表3，試驗安排見表4。

表3 測定條件星點設計因素水平

表4 測定條件星點試驗設計與結果

根據表3取老百姓大藥房全蝎粉末共13份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL容量瓶，依據表3加入不同量甘油，用試驗用水合氯醛試液定容，充分搖勻后，精密吸取0.04 mL進行裝片，每份樣品平行裝片30張，于顯微鏡下觀察并記錄剛毛數，求其RSD值，將試驗數據用SPSS 19.0和OriginPro 9.1進行二元線性及非線性擬合做數據對比畫出函數三維圖分析優化全蝎剛毛顯微特征常數測定條件，根據條件求出全蝎剛毛顯微特征常數值。

2.3.1 二元線性分析 結果用SPSS 19.0輸入數據處理得到由二元線性分析得到函數關系式：Y=-0.025X1+0.219X2+30.878，R2=0.347，P=0.118(P>0.05)，擬合度很差且顯著性不好。

2.3.2 二元非線性擬合 結果用OriginPro 9.1進行二元非線性擬合，剔除相關性差的組分，再次進行二元非線性擬合，得到結果函數關系式為Y=38.894 68-0.025 04X1-4.366 57X2+0.000 025 308 6X12+0.379 86X2-0.000 503 808X1X2，R2=0.753 45，P=0.000 098(P<0.01)(X1代表全蝎用量、X2代表甘油量)，擬合度較好，顯著性高。

2.3.3 響應曲面圖 用OriginPro 9.1軟件繪制二次多項式模型中兩因素對評價指標RSD的三維效應曲面圖(見圖2)，可直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響，有助于確定最佳顯微常數測定條件范圍。

2.3.4 條件優化與預測因變量 曲面圖是三維圖，能表達含兩個自變量的函數，基于已建立的函數模型，對全蝎的顯微特征常數測定條件進行最優化設計，為使試驗設計結果Y值(RSD值)最小，可得到當全蝎用量為556 mg，甘油量為5.8 mL時，混勻度最好，RSD最低值為18.586 5%，最終選取優化條件為全蝎556 mg,甘油量為6 mL。

2.4 驗證試驗 為了確定建立的模型與試驗結果是否相符，通過進一步試驗對結果模型可靠性進行驗證，驗證試驗中各因素的取值為上述的優化條件，分別對5家藥店的全蝎進行試驗測定，得到結果見表5。將得到的值與預測值做比較，偏差結果見表6。

表5 全蝎中剛毛數值測定的星點設計驗證試驗結果

表6 各全蝎樣品優化條件結果與預測值偏差

結果表明,實際值與預測值偏差較小，說明模型可靠，用效應面法來優化全蝎的剛毛顯微特征常數測定條件是可行的。

2.5 全蝎各樣品剛毛顯微特征常數值測定 按照設計結果分別精密稱取全蝎5種樣品粉末，水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL容量瓶中，加入優化甘油量，用水合氯醛試液定容搖勻。精密吸取溶液0.04 mL，分別平行裝片30張，觀察剛毛并計數，按公式(1)計算全蝎剛毛顯微特征常數值(P)，結果見表7。

P=(X × V)/(V′× W)

(1)

式中：W-樣品質量(mg)；V-定量樣品混懸液總體積(mL)；P-定量樣品顯微特征常數值(個/mg)；V′-蓋玻片下樣品混懸液體積(mL)；X-每片蓋玻片下樣品顯微剛毛數。

表7 各全蝎樣品剛毛顯微特征常數數值測定結果

3 結論與討論

本試驗采用556 mg的全蝎粉末，6 mL的甘油量對全蝎的剛毛顯微特征常數進行測定，結果精確度、穩定性、重復性好。對顯微常數的測定常用的正交設計與均勻設計，這兩種方法試驗次數少，操作簡便，但是得到的結果精確度不高，建立的數學模型預測性差，難以全面反映自變量與因變量之間的相關性，本試驗采用星點設計效應面優化法優化全蝎剛毛的顯微常數測定條件，得到的結果與預測值非常接近，混勻度高，說明采用星點設計建立的數學模型優化顯微常數測定條件是可行的，對于目篩的選用是顯微常數測定的因素之一，因為為非連續變量，所以在采用星點設計前，先通過確定其他因素不變改變目篩得到混勻度結果最好的目篩來進行下面的星點設計。