布魯頓酪氨酸激酶(BTK)信號通路與疾病

陳瀟，龔國清

(中國藥科大學藥理學研究室，江蘇 南京 211198)

生化分析和體內基因靶向實驗已經暗示酪氨酸激酶是B細胞發育和功能中細胞分化，增殖，存活和遷移的關鍵調節劑。其中一種，布魯頓酪氨酸激酶(BTK)，在人類的原發性免疫缺陷X連鎖性丙種球蛋白血癥(XLA)和小鼠的X連鎖免疫缺陷(Xid)中發生突變。XLA和Xid的特征在于分別在前B細胞階段幾乎完全阻止B細胞發育和成熟B細胞的分化缺陷[1-2]。自1993年鑒定BTK作為該疾病的缺陷基因以來，我們對其發病機制的認識已經大大深入。在其發現后不久，證明了BTK在成熟B細胞中與B細胞受體(BCR)信號傳導密切相關。

除T細胞和NK細胞外，BTK幾乎在造血系統的所有細胞中表達，并且還參與B細胞中的許多其他信號傳導途徑，包括Toll樣受體(TLR)和趨化因子和Fc受體信號傳導。在BTK被成功鑒別后，很快BTK小分子抑制劑便被開發出來，并且在體外白血病細胞中顯示出具有抗腫瘤活性[3]。2007年，一種不可逆BTK抑制劑依魯替尼(Ibrutinib,代號PCI-32765)的發現[4]，是抑制B細胞惡性腫瘤中的信號轉導治療的里程碑。

依魯替尼在2013年被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準為用于治療套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL)[5]，2015年，獲得FDA和歐洲藥品管理局(EMA)的批準，用于治療有癥狀的Waldenstr?m巨球蛋白血癥(WM)患者[6]。臨床前研究以及臨床試驗現已提供證據表明BTK抑制劑的抗腫瘤活性在很大程度上取決于其在BCR信號傳導之外的作用，例如B細胞中的趨化因子和TLR信號傳導或骨髓微環境中破骨細胞或其他細胞產生腫瘤支持因子[7]。

此外，小鼠中的各種研究證明了適當調節BTK活性的至關重要性。例如，B細胞中BTK的轉基因過表達與自發生發中心(GC)形成，自身抗體產生和系統性紅斑狼瘡(SLE)樣自身免疫病理學相關[8]。相反，在患有膠原誘導的關節炎(CIA)的小鼠中或在患有SLE樣疾病的小鼠中的依魯替尼治療降低了自身免疫癥狀[9-10]。

在這篇綜述中，我們討論了BTK在BCR信號傳導途徑與其他信號通路中的功能，以及BTK缺陷對正常生理功能造成的影響與BTK抑制對疾病的治療意義。

1 BTK結構與BCR信號

1.1 BTK的結構與活性調節 BTK是由659個氨基酸組成的蛋白質，與在肝細胞癌中表達的酪氨酸激酶(TEC)、誘導型T細胞激酶(ITK)、靜息淋巴細胞激酶(RLK)和骨髓表達激酶(BMX)4個成員一起，屬于非受體酪氨酸激酶的Tec家族，在整個進化過程中都非常保守，高度表達于造血細胞[11]。

BTK的結構域結構類似于SRC家族激酶的結構域結構，并且它包含SRC同源結構域(SH結構域)SH2和SH3，以及催化結構域。然而，與SRC家族激酶不同，BTK具有氨基末端的pleckstrin同源(PH)結構域和富含脯氨酸的TEC同源(TH)結構域，其含有鋅指基序，這對于最佳活性和穩定性是重要的[12]。SRC家族激酶組成性地與膜結合，而BTK在細胞質中，并且僅會在其PH結構域與由PI3K產生的磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)結合時短暫地募集到膜上[13]。

在B細胞中，BTK活化由PH結構域介導的質膜結合引發，其能夠通過脾酪氨酸激酶(SYK)或SRC家族激酶如LYN在激酶結構域的殘基Y551處磷酸化。這促進了BTK的催化活性，并導致其在SH3結構域中的位置Y223處的自身磷酸化[13-14]。B細胞譜系中Y223F-BTK的轉基因表達基本上校正了BTK缺陷Xid小鼠的表型[15]，證明了在體內前B細胞或B細胞中BTK功能不需要Y223F自磷酸化。因此，SH3結構域，特別是SH3結構域Y223自身磷酸化位點的功能意義仍不清楚，Y223的磷酸化似乎不影響BTK活性[15]。在BCR刺激后，成熟B細胞中BTK水平增加，但所涉及的轉錄后機制十分復雜，并且至今為止僅有部分得到研究證實。包括microRNA-185(miR-185)調節BTK表達[16]，BCR與Toll樣受體(TLR)相互作用，BTK通過涉及核因子-κB(NF-κB)的途徑刺激其自身啟動子的轉錄，啟動蛋白酶體依賴性陽性自動調節反饋環[17-18]。

1.2 BCR信號激活BTK BCR復合物與二硫鍵連接的Igα-Igβ異二聚體非共價結合。在抗原與BCR結合后，SRC家族蛋白酪氨酸激酶LYN磷酸化Igα和Igβ免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)，從而產生SYK的停靠位點[19]。同時，LYN磷酸化BCR共受體CD19的細胞質尾部中的酪氨酸殘基，這使得能夠結合和激活PI3K和VAV[20]。除了CD19，用于PI3K的細胞質B細胞銜接子也可以募集PI3K并激活。PI3K產生PIP3，其是用于激活下游途徑的重要第二信使。PI3K通過PIP3-PH結構域相互作用將BTK吸引至細胞膜，其允許SYK和LYN通過Y551的反式磷酸化完全激活BTK[21]。BTK活化可以通過磷酸酶PTEN和含有SH2結構域的肌醇5′磷酸酶1(SHIP1)調節，其使PIP3去磷酸化從而抑制BTK膜結合。一旦SYK被激活，通過募集和磷酸化65kDa的含有SH2結構域的白細胞蛋白(SLP65)將信號傳導至下游效應子，其作為各種信號分子的支架，包括SYK、BTK及其關鍵底物磷脂酶C-γ2(PLCγ2)[22]。

1.3 BTK的下游信號傳導 SLP65介導的BTK和PLCγ2的募集完成了所謂的微信號體的形成，其包括VAV，PI3K，BTK，SLP65和PLCγ2。BTK主要負責Y753和Y759位置的PLCγ2磷酸化，這對PLCγ2的脂肪酶活性至關重要[23]。此外，BTK不依賴于其激酶活性，可以募集磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)，從而刺激產生磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)的正反饋環，PIP2可作為PI3K和PLCγ2的底物[24]。

被BTK活化后，PLCγ2切割PIP2以產生兩個第二信使，肌醇三磷酸(iIP3)和二酰基甘油(DAG)，其激活分叉和部分重疊的信號傳導途徑[25]。DAG介導蛋白激酶C(PKC)β的激活，其誘導細胞外信號調節激酶ERK1和ERK2的RAS信號傳導依賴性磷酸化。與ERK1和ERK2不同，其他絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)如p38，可由PLCγ2誘導，無須通過RAS進行中間信號傳導[26]。重要的是，PKCβ還通過支架復合物激活NF-κB途徑，該支架復合物包括含有半胱天冬酶募集結構域的蛋白11(CARD11)，BCL10和黏膜相關淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1(MALT1)[27]。

1.4 BTK在pre-BCR信號傳導中的作用 由于人類pre-BCR結合后形成由酪氨酸磷酸化的LYN、SYK、SLP65、PI3K、BTK、VAV和PLCγ2組成的筏相關Ca2+信號傳導模塊，所以可以假設由pre-BCR和BCR介導的信號通路是相似的[28]。在小鼠中，在pre-BCR信號在功能上與白細胞介素7受體(IL-7R)信號傳導途徑相互作用，除了Janus激酶3(JAK3)-信號轉導和轉錄激活因子5(STAT5)信號傳導之外，它還激活SRC家族激酶和ERK途徑。IL-7R和pre-BCR信號傳導協同誘導前B細胞的增殖[29]。

缺乏關鍵的pre-BCR分子的小鼠，例如SYK、SLP65、BTK和PLCγ2，僅在前B細胞階段顯示出一些發育阻滯。SLP 65缺陷的白血病前B細胞在細胞表面表達高水平的pre-BCR，但這不可能有助于它們在體內的強增殖能力，因為SLC的轉基因過表達不誘導或增加白血病的發展[30]。在正常的前B細胞中，SLP65通過直接抑制JAK3-STAT5信號傳導途徑下調IL-7介導的前B細胞增殖和存活[31]。Btk缺陷型小鼠不會發生前B細胞白血病，然而，與其激酶活性無關，BTK確實與SLP65合作調節IL-7介導的前B細胞增殖和存活，這表明BTK可以作為腫瘤抑制劑起作用[32]。

2 BTK在其他信號通路中的作用

2.1 BTK與趨化因子受體信號傳導 生化分析和體外黏附和遷移測定已經確定BTK參與趨化因子受體途徑，其對于B細胞運輸，組織歸巢和體內平衡是必需的。BTK是趨化因子受體CXCR4和CXCR5的關鍵信號傳導因子[33]。由骨髓和生發中心的基質細胞高度表達的CXC-趨化因子配體12(CXCL12)誘導BTK活化，最可能是通過BTK和CXCR4連接的異源三聚體G蛋白亞基之間的直接相互作用。Gα和Gβγ亞基都可以直接結合BTK的PH結構域和相鄰的TH結構域。因為在缺乏LYN或SYK的B細胞中發現CXCL12控制的遷移減少，所以可以推測這些激酶在CXCR4連接后激活BTK[34]。在SYK抑制劑的存在下，在Y551誘導CXCL12誘導BTK磷酸化的發現證實了這一點。在體外實驗中，依魯替尼可以抑制MCL和CLL細胞中CXCL12誘導和CXCL13誘導的PLCγ2、ERK1、ERK2、JNK和AKT的磷酸化，以及細胞黏附和遷移，這與BTK在趨化因子受體信號傳導中起關鍵作用的觀點一致[35]。BTK在體內趨化因子信號傳導中的作用首先通過小鼠中BTK缺陷型B細胞的過繼轉移實驗證明，其顯示B細胞歸巢至淋巴結特別受影響[34]。

2.2 BTK和TLR信號通路 BTK在TLR信號中的作用首先通過發現BTK缺陷型B細胞的增殖響應于TLR4配體細菌脂多糖(LPS)而降低。TLR信號傳導誘導下游轉錄因子NF-κB，激活蛋白1(AP1)和干擾素調節因子3(IRF3)其在B細胞中導致活化標志物的上調、增殖、抗體分泌、類別轉換重組和產生促炎細胞因子。BTK可與大多數TLR的細胞質Toll/IL-1受體(TIR)結構域以及下游銜接子MyD88，TRIF和MyD88銜接子樣蛋白(MAL)和IL-1R相關激酶1(IRAK1)直接相互作用[36]。TLR9和BCR刺激可以協同誘導IL-6的產生，因此BTK是自噬體樣區室中TLR9和BCR共定位所必需的。由于BCR信號傳導在細胞表面開始并且當其傳遞至細胞內區室時繼續激活MAPK，可以推測TLR和BCR信號傳導通過BTK互連[37]。

3 BTK缺陷病

3.1 X連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA) XLA是原發性免疫缺陷病(PIDs)的遺傳形式之一。它是由BTK基因突變引起的，導致骨髓內B細胞的發育和成熟缺陷，外周血中成熟B細胞顯著減少或完全缺失。XLA患者中的前B細胞體積小，與BTK在誘導或其增殖中的基本功能一致[38-39]。由于缺乏成熟的B細胞，XLA患者血清中所有主要免疫球蛋白(Ig)的水平顯著降低，因此會遭受嚴重和慢性細菌感染。XLA患者在其循環中具有<1%的正常B細胞數量，導致明顯缺乏漿細胞，因此外周血中所有亞類的Igs水平非常低[40]。Mirsafian等[41]利用深度高通量RNA測序(RNA-Seq)方法，發現BTK突變可能導致先天免疫系統的失調，并增加XLA患者單核細胞中細胞凋亡的易感性。通過分析該疾病的雌性攜帶者中循環B細胞的X染色體失活狀態，顯示XLA的發育缺陷是B細胞譜系固有的。載體表現出突變體BTK基因對X染色體的單側失活，表明在活性X染色體上具有缺陷BTK等位基因的B譜系細胞具有選擇性缺陷。因此，XLA的女性攜帶者是健康的并且沒有表現出免疫異常[42-43]。

在母體給予的Ig消失后，男孩患者通常在上呼吸道或下呼吸道中出現嚴重或復發的包囊細菌感染，主要是中耳炎、鼻竇炎和肺炎，少部分會患腦膜炎[44-45]。病毒感染通常不會引起XLA的異常問題，因為T細胞和NK細胞功能正常。XLA患者終生且完全依賴抗生素和靜脈或皮下Ig替代療法[46]。

3.2 小鼠的X連鎖免疫缺陷(Xid) Xid 表型的CBA/N小鼠的免疫缺陷是由單個保守蛋白酪氨酸激酶BTK結構改變引起的遺傳疾病，其特征是骨髓中B細胞發育前的部分阻斷，外周成熟B細胞數量的中度減少，淋巴器官IgM和IgG3的循環抗體滴度低[47]。與XLA相反，表達R28C-BTK突變的Xid小鼠或在BTK基因中具有靶向破壞的小鼠僅表現出輕度B細胞病癥。與野生型小鼠的B細胞相比， BTK缺陷型小鼠中的外周B細胞具有明顯的存活劣勢[48-49]。BTK缺陷型小鼠對T細胞非依賴性Ⅱ型抗原無反應，與野生型同窩小鼠相比，抗原特異性血清IgM和IgG3水平顯著降低，對T細胞依賴性抗原的初級反應也受到損害[50]。

Xid小鼠對PR8流感感染的免疫反應相對正常。X-31流感病毒鼻內感染BTK缺陷小鼠和同窩野生型小鼠，發現二者病毒清除率相當。在流感感染后，野生型小鼠的肺中B-1細胞數量增加，而在幼稚BTK缺陷小鼠中，肺和胸膜腔中不存在B-1細胞，并且在流感感染后不誘導B-1細胞[51]。

BTK缺陷的Xid表型還可導致對各種病原體的易感性降低，與WT對照相比，感染肺炎支原體的Xid小鼠顯示出存活率增加和組織損傷減少，可能是因為它們未能產生破壞性抗原-抗體反應[52]。

4 BTK抑制對疾病的治療

4.1 Waldenstr?m巨球蛋白血癥(WM) WM以其發現者命名，是一種罕見的淋巴增生性疾病，其特征是骨髓和其他器官中淋巴漿細胞淋巴瘤細胞的惡性積聚，以及血清中單克隆IgM副蛋白的存在[53]。WM是一種異質性疾病，可出現血細胞減少、淋巴結腫大、肝脾腫大、高粘血癥、神經病變、冷球蛋白血癥或淀粉樣變性。盡管WM患者往往存活數年，甚至數十年，病情無法治愈，并且絕大多數患者的疾病過程表現為影響患者生活質量和日常生活活動的癥狀性疾病復發[54]。

在WM患者中，MyD88中常見的L265P點突變導致MyD88的組成型活性形式，且BTK也具有誘導活性，盡管所涉及的機制仍不清楚。最近顯示MyD88L265P與WM細胞中的磷酸化BTK結合，這表明BTK可能在這些細胞中的MyD88L265P中具有直接作用[55]。

依魯替尼治療WM細胞可消除MyD88L265P-BTK相關性并降低NF-κB活化。在兩種WM細胞系和原代WM細胞中，當IRAK1和IRAK4也被抑制時，依魯替尼誘導細胞凋亡并增加細胞凋亡水平。因此，依魯替尼治療MyD88L265P突變WM細胞的功效可能完全依賴于NF-κB活化的消除[56]。

4.2 慢性淋巴細胞白血病(CLL) CLL的特征在于血液中非增殖性單克隆CD5+成熟B細胞的積累。CLL B細胞通常具有低表面IgM表達并顯示對BCR連接的無反應性反應，這表明慢性BCR內化和信號轉導[57]。一些發現表明BTK信號傳導基本上有助于CLL的啟動或維持。在CLL小鼠模型中，BTK缺乏使腫瘤形成消失，而轉基因BTK過表達增加腫瘤發生率和總體死亡率[8]。體外用依魯替尼治療，可以減少CLL細胞的存活和增殖，消除了BCR刺激的AKT和ERK磷酸化，以及VCAM1介導的黏附和淋巴細胞胞質蛋白1(LCP1)的表達，是F肌動蛋白交聯分子，對CXCL12介導的遷移至關重要[35]。

BTK的抑制干擾多種途徑，這些途徑對于CLL細胞存活，增殖和體內遷移可能是重要的。BTK信號傳導可能支持CLL細胞向淋巴結中的增殖中心遷移，因為體外伊布魯尼治療CLL細胞有效阻斷CXCL12誘導的和CXCL13誘導的遷移。此外，當與B細胞激活因子(BAFF)、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6、IL-4和CD40L一起培養時，依魯替尼處理的CLL細胞在體外顯示出降低的活力，這表明BTK抑制可能抵消促存活因子在CLL微環境中的作用。當CLL細胞與護士細胞(NLCs)共培養時，CLL細胞存活，增殖和CCL3和CCL4產生的減少也表明了破壞淋巴結微環境中共刺激反饋的可能性[58]。

4.3 套細胞淋巴瘤(MCL) MCL顯著偏向的BCR譜表表明抗原刺激在其發病過程中起著至關重要的作用，但所涉及的抗原是未知的。在有限的患者組中觀察到LYN、SLP65、SYK和PKCβ的組成型磷酸化，提示BCR信號傳導的促存活作用。此外，發現SYK基因和SYK蛋白過表達，并且MCL細胞顯示NF-κB和AKT的組成性激活，這可能反映BCR或TLR信號的激活[59]。BTK在MCL中顯示出高表達，并且在未刺激的原代MCL細胞中觀察到Y223處的BTK自身磷酸化增加。依魯替尼治療原代MCL細胞或細胞系導致活力降低，以及在BCR活化或響應CXCR4或CXCR5時黏連和遷移受損。接受間歇性或連續依魯替尼治療的MCL患者分別有復發性淋巴細胞增多癥或單次淋巴細胞增多癥[60]。

4.4 多發性骨髓瘤 多發性骨髓瘤細胞來源于不再在其細胞表面表達BCR的漿細胞。為了存活和增殖，多發性骨髓瘤細胞似乎依賴于由增加的破骨細胞活性和骨重建產生的信號。骨髓基質細胞，破骨細胞和成骨細胞為多發性骨髓瘤細胞提供關鍵的激活和歸巢信號，例如增殖誘導配體(APRIL)、IL-6和CXCL12[61]。

在小鼠中，BTK和TEC對于成骨細胞形成是必不可少的，其由NF-κB配體的受體活化劑(RANKL)誘導。與此觀察結果一致，依魯替尼阻斷RANKL誘導的BTK和下游PLCγ2的磷酸化，并通過骨吸收活性測量體外抑制人破骨細胞功能。在來自患有多發性骨髓瘤的患者的破骨細胞或骨髓基質細胞中，依魯替尼下調腫瘤支持因子的產生，包括CCL3、轉化生長因子β、APRIL和CXCL12。依魯替尼阻斷了CXCL12誘導的多發性骨髓瘤細胞的黏附和遷移，并減少了由IL-6引發的多發性骨髓瘤細胞生長和存活[62]。依魯替尼還抑制了多發性骨髓瘤樣細胞在體外形成集落的潛力，可以想象這種藥物也可能破壞多發性骨髓瘤細胞中的BTK信號傳導。多發性骨髓瘤細胞中的BTK抑制也可能阻斷涉及疾病進展的其他途徑，因為多發性骨髓瘤中的TLR信號傳導可能增加疾病進展[63]。

4.5 自身免疫性疾病 類風濕性關節炎(RA)是一種使人衰弱的全身性自身免疫性疾病，其特征在于在受影響的關節中循環自身抗體、滑膜炎癥、血管翳形成以及軟骨和骨質破壞[64]。已經進行了幾項研究以研究BTK抑制在動物模型中的自身免疫中的功效。

依魯替尼在人B細胞中選擇性地阻斷BCR信號傳導，但不影響T細胞受體(TCR)信號傳導。Chang等[65]通過對依魯替尼在體內疾病模型中的作用研究了其在關節炎中的作用機制。依魯替尼治療在CIA模型和CAIA模型中降低了在該模型中起重要作用的促炎細胞因子和趨化因子，包括滑膜和血清中IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α、KC和IFN-γ的水平；對關節滑膜炎、血管翳形成、軟骨和骨破壞的有效抑制，并且觀察到BCR介導的B淋巴細胞增殖和功能的顯著抑制。RN486是BTK的選擇性可逆抑制劑[66]，在體外處理限制了人和鼠B細胞中CD69的上調以及向漿細胞的分化。它還限制了PBMC-B細胞共培養系統中體外IL-6和IL-2的產生。這表明BTK抑制也可以影響B細胞的細胞因子產生，盡管所涉及的途徑仍有待闡明。

除類風濕性關節炎外，還在系統性紅斑狼瘡(SLE)模型中研究了BTK抑制劑的功效。在患有狼瘡的MRL.lpr/lpr小鼠中，用依魯替尼治療限制了蛋白尿和血尿素氮水平的升高，說明腎功能障礙或損傷得到了保護。在該模型中，自身抗體和免疫復合物的形成對于疾病是必需的，并且在依魯替尼治療后血清抗dsDNA抗體水平降低[9]。依魯替尼在B6.Sle1/B6.Sle1.Sle3狼瘡易感小鼠發病前給藥，降低了其自身反應性IgG但不降低IgM的水平，小鼠脾臟大小和脾細胞數量顯著降低。這是由于活化的B細胞、GC B細胞和血漿母細胞，間接限制了CD4+和CD8+T細胞的活化，且巨噬細胞，樹突細胞和嗜中性粒細胞未受影響，這表明依魯替尼單獨在B細胞中的作用足以抑制T細胞。與未處理的對照相比，處理的小鼠表現出腎損傷明顯減少[10]。RN486在NZB×NZW狼瘡小鼠疾病發作后，與未給藥治療的對照相比，停止了蛋白尿的進展并且降低了腎臟中IgM、IgG和C3以及巨噬細胞浸潤的沉積。RN486抑制了B細胞活化，并且dsDNA特異性IgG漿細胞的數量減少，導致抗dsDNA抗體的血清水平降低，而不影響總漿細胞數量[67]。

以上數據表明，通過靶向不同病理途徑抑制BTK，可以抑制或預防不同自身免疫模型中的疾病癥狀。

5 結論與展望

在這篇綜述中，我們概述了我們目前對BTK信號通路的研究進展，以及BTK缺陷疾病與BTK抑制劑能夠有效治療的相關疾病。

近年來在確定BTK抑制劑的作用機制方面取得了很大進展，BTK參與不同的病理機制，現在看來很可能在很多情況下BTK抑制對腫瘤進展的影響是由B細胞上的各種受體和對微環境刺激的反應產生的信號的復雜相互作用的結果。因此，對惡性腫瘤中基因組畸變背景下BTK信號傳導的致癌作用的新見解對于優化BTK靶向治療劑的使用是至關重要的。需要更多的研究來了解哪些患者從哪種特定化合物中獲益最多。高通量組合篩查策略應有助于確定可以優先用于臨床研究的依魯替尼組合。預期這種組合方案通過阻止對BTK抑制的抗性的發展和避免終身用抑制劑治療而產生持久的反應。

我們已經討論了BTK在自身免疫病理學中的潛在意義。然而，目前尚不清楚BTK蛋白是否在各種外周血B細胞亞群中差異表達，或者在自身免疫的情況下其在B細胞中的表達或活性是否增加。來自自身免疫動物模型中BTK抑制的有希望的數據表明，BTK的藥理學調節可以為治療B細胞分化中的自身免疫BTK信號傳導和RA和SLE等自身免疫疾病提供有效的新治療策略。