苦瓜皂苷的急性毒性及解熱抗炎作用研究

王亞軍，張文煊，李宇清

(1.南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)又名涼瓜，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物，具有清熱祛暑、明目解毒、利尿涼血、解勞清心、益氣壯陽(yáng)的功效[1]，可用于治療熱病煩渴、中暑發(fā)熱、痢疾等癥。現(xiàn)代研究表明苦瓜具有改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝[2-3]、抗菌[4]、抗癌[5]等功效。苦瓜富含多種生物活性物質(zhì)如糖苷、皂苷、黃酮類、生物堿類、三萜類、蛋白及類固醇等[6]。苦瓜苷包括總皂苷、黃酮苷等，苦瓜總皂苷即為苦瓜皂苷。苦瓜皂苷是苦瓜的藥理活性成分之一[7],本課題組前期研究了苦瓜總皂苷的利尿及其對(duì)腎臟的保護(hù)作用[8]，現(xiàn)探求苦瓜皂苷的急性毒性及解熱抗炎作用，以發(fā)掘苦瓜新的藥用功效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑 苦瓜皂苷(批號(hào)：20181212，桂林實(shí)力科技有限公司，總皂苷含量≥50%)；干酵母(批號(hào)：20181002，安琪酵母股份有限公司)； 阿司匹林腸溶片(批號(hào)：180711，江蘇平光制藥有限公司)；地塞米松(批號(hào)：180510，浙江仙鋸制藥股份有限公司)；依文思蘭(批號(hào)：20180305，上海慧濟(jì)生物有限公司)；二甲苯(批號(hào)：T20180825，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(批號(hào)：T20180913，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，18～22 g，SPF級(jí)SD大鼠，體重180～220 g，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK2009-0002，合格證號(hào)：0006488、0006009。

1.3 儀器 DT-100型電子天平(美國(guó)雙杰兄弟有限公司)；Microlife MT-1671電子體溫計(jì)(華略電子有限公司)；EL-204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；UV-1800型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 苦瓜皂苷對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)[9]采用改良寇氏法考察苦瓜皂苷對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。先用一定數(shù)量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定動(dòng)物0%與100%死亡率的用藥范圍。取昆明小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，10只/組，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別在20.4～29.6 g·kg-1范圍內(nèi)按照1∶0.91的比例設(shè)置給藥劑量，動(dòng)物禁食12 h后稱重，分別灌胃給予苦瓜皂苷，灌胃容量為40 mL·kg-1，灌胃后連續(xù)觀察動(dòng)物行為狀態(tài)的改變，記錄各組動(dòng)物的中毒和死亡情況，計(jì)算 LD50。

2.2 苦瓜皂苷對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的影響[10]取雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組(蒸餾水)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林 10 mg·kg-1)，苦瓜苷高(0.576 g·kg-1)、中(0.288 g·kg-1)、低(0.144 g·kg-1)3個(gè)劑量組。各組動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第1天起每天禁食不禁水18 h后測(cè)定肛溫1次，連續(xù)4 d，作為大鼠體溫基 礎(chǔ)值。第4天測(cè)定肛溫后，立即于背部皮下注射20%酵母混懸液(10 mL·kg-1)，30 min后按照分組灌胃給藥1次，于注射酵母后6 h測(cè)定大鼠肛溫。

2.3 苦瓜皂苷對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響[10]取18～22 g雄性小鼠50只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松 5 mg·kg-1)、苦瓜皂苷高、中、低3個(gè)劑量組，分別給藥 0.288、0.144、0.072 g·kg-1。所有動(dòng)物均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。末次藥后60 min后，于右耳滴0.02 mL二甲苯致炎，左耳不涂作為空白對(duì)照。15 min后脫頸椎處死，剪下左右耳，并于雙耳相同位置對(duì)稱打下相同大小的耳片，電子天平稱重。計(jì)算腫脹度(腫脹度=右耳片重-左耳片重)，并計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=(模型對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型對(duì)照組平均腫脹度×100%

2.4 苦瓜皂苷對(duì)小鼠腹腔通透性的影響[11]小鼠分組及給藥方法同“2.3”項(xiàng)下，末次給藥60 min后，尾靜脈注射0.25%依文思蘭，同時(shí)腹腔注射冰醋酸，15 min后，脫頸椎處死，注入6 mL生理鹽水沖洗腹腔，將腹腔洗出液于2 000 rpm離心10 min，取上清液于590 nm處測(cè)定吸光值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 苦瓜皂苷對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn) 各組小鼠灌胃后自發(fā)活動(dòng)、梳理毛發(fā)活動(dòng)明顯減少，動(dòng)物多呈俯臥狀態(tài)，且多數(shù)動(dòng)物有腹瀉現(xiàn)象。服用苦瓜皂苷劑量為20.4 g·kg-1組的全部動(dòng)物約在用藥5 h后活動(dòng)能力逐漸恢復(fù)，動(dòng)物服用劑量越大，活動(dòng)能力恢復(fù)所需時(shí)間越長(zhǎng)。部分動(dòng)物服用苦瓜皂苷后死亡，解剖發(fā)現(xiàn)胃腸充盈，且死亡率隨服用劑量增加而升高。服用劑量為29.6 g·kg-1的苦瓜皂苷動(dòng)物死亡率為100%，服用最低劑量20.4 g·kg-1苦瓜皂苷的動(dòng)物死亡率為10%，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算所得半數(shù)致死量(LD50)為(25.02±1.41)g·kg-1。

3.2 苦瓜皂苷對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。各組動(dòng)物注射干酵母后6 h體溫均顯著高于基礎(chǔ)值(P<0.001)。阿司匹林組動(dòng)物體溫升高程度顯著低于模型對(duì)照組，高、中劑量的苦瓜皂苷均不能降低發(fā)熱動(dòng)物的體溫，僅低劑量苦瓜皂苷(0.144 g·kg-1)有降低大鼠發(fā)熱體溫的趨勢(shì)。

表1 苦瓜皂苷對(duì)發(fā)熱大鼠的體溫影響

注：與同組基礎(chǔ)體溫比較，*P<0.001；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05

3.3 苦瓜皂苷對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。連續(xù)口服苦瓜皂苷7 d，3個(gè)苦瓜皂苷組動(dòng)物受二甲苯刺激引發(fā)的耳腫脹均有不同程度的減輕，尤其是高劑量(0.288 g·kg-1)對(duì)耳腫脹的抑制率達(dá)到57.51%，且與模型對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.001)。

表2 苦瓜皂苷對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.001

3.4 苦瓜皂苷對(duì)小鼠腹腔通透性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。連續(xù)口服苦瓜皂苷7 d后，苦瓜皂苷高(0.288 g·kg-1)、中劑量(0.144 g·kg-1)均能顯著抑制冰醋酸刺激引起的腹腔通透性增加，減少腹腔依文思蘭滲出(P<0.05)，低劑量(0.072 g·kg-1)能輕度抑制腹腔依文思蘭滲出，但其作用未達(dá)顯著性差異。

表3 苦瓜皂苷對(duì)小鼠腹腔通透性的影響

注：與模型對(duì)照組比較 ，#P<0.05，*P<0.001

4 討論

苦瓜皂苷的半數(shù)致死量(LD50)為(25.02 ±1.41)g·kg-1，人日用量為0.36 g/60 kg。按照相對(duì)體表面積換算，半數(shù)致死量的人等效劑量為2.085 g·kg-1，相當(dāng)于苦瓜皂苷推薦人日用量的347.5倍。根據(jù)GB15193-2003急性毒性劑量分級(jí)表，苦瓜皂苷的毒性水平為實(shí)際無(wú)毒級(jí)[12]，在一定劑量?jī)?nèi)使用是安全的。單次口服苦瓜皂苷對(duì)干酵母引起的大鼠體溫升高有較弱的退熱效果,且連續(xù)7 d口服苦瓜皂苷可顯著抑制冰醋酸誘導(dǎo)的腹腔通透性亢進(jìn)，并對(duì)二甲苯引起的小鼠耳腫脹有一定的抑制作用，說(shuō)明苦瓜皂苷能對(duì)小鼠的急性炎癥反應(yīng)產(chǎn)生抗炎效果，與肖瑩等[13]研究的苦瓜對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用相吻合。

苦瓜是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，因其毒副作用較小，它的降糖降脂功效一直被廣泛地應(yīng)用[14]。苦瓜皂苷是苦瓜中的有效成分之一，主要以葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的形式存在，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等多種生物活性[15]。有研究表明，苦瓜皂苷粗制品的得率為2.37%，且苦瓜果實(shí)的不同部分(苦瓜瓤vs苦瓜果肉)含有的總皂苷得率差異顯著[16]。本次探討了苦瓜皂苷的解熱抗炎作用，還沒有對(duì)苦瓜皂苷生物利用度的系統(tǒng)研究，但是已經(jīng)有研究提示，苦瓜可以改善糖耐量，緩慢降低血糖而不會(huì)誘發(fā)低血糖[17]，并且能減少糖尿病的并發(fā)癥[18]。另有苦瓜皂苷的藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)[19]，通過口服苦瓜皂苷繪制的血藥濃度曲線表明，苦瓜皂苷能夠通過腸道吸收后進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)揮其藥理活性。以上研究均從側(cè)面表明，口服苦瓜皂苷具有能夠支撐其發(fā)揮藥理活性的生物利用度，則下一步需繼續(xù)研究苦瓜皂苷的生物利用度，以期實(shí)現(xiàn)較高的藥用價(jià)值。總之，由于苦瓜的有效成分比較多，作用靶點(diǎn)多樣，所以苦瓜的藥理作用廣泛，本研究也為以后苦瓜更多藥用價(jià)值的發(fā)掘提供參考。