威代爾冰葡萄酒揮發性成分的全二維氣相色譜/飛行時間質譜分析

黃 玲 ，李記明 ，李蘭曉 ，徐 巖 ，唐 柯 *

（1. 江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122；2. 張裕葡萄釀酒股份有限公司 研發中心，山東 煙臺，264000）

冰葡萄酒是利用-8℃的氣溫下，在葡萄架上自然冰凍的葡萄釀造而成的葡萄酒 （Vintners Quality Alliance，VQA），其獨特的釀造工藝使其與普通葡萄酒在風味特征上具有較大差異。 中國桓仁地區因其具備釀造冰葡萄酒的典型的氣候特征，現在已經成為世界上重要的冰葡萄酒生產地之一。 隨著中國冰葡萄酒市場的逐漸擴大，冰葡萄酒也越來越受到廣大消費者的歡迎[1]。 然而中國冰葡萄酒尚存在風格特點不明確的問題，并且在品質上較世界主要冰酒產國（加拿大、德國等）生產的冰葡萄酒還有待改善[2]，而解析和確定冰葡萄酒中的香氣成分是實現冰葡萄酒風味調控、提高冰葡萄酒品質的首要問題。

近年來，葡萄酒中揮發性成分的檢測分析主要基于一維氣相色譜[3]。 李艷霞等[4]采用頂空固相微萃取結合氣相色譜及質譜聯用對威代爾冰葡萄酒中的香氣成分進行了分析，分離并定性了其中的59種香氣化合物，主要為酯類、醇類、酸類和呋喃類化合物。 隨后，王玉峰等[5]、秦紹智等[6]、王蓓等[7]分別采用溶劑萃取法結合氣-質聯用、液液萃取結合氣-質聯用以及攪拌棒吸附萃取結合氣-質聯用等方法對不同葡萄品種冰葡萄酒（包括赤霞珠、威代爾及雷司令冰葡萄酒）中主要香氣成分進行了分析。 在氣-質聯用的基礎上，馬玥等[8]進一步采用固相萃取結合嗅聞 （gas chromatography-olfactometry，GC-O）對威代爾冰葡萄酒中具有重要貢獻的香氣化合物展開了研究，并在威代爾冰酒中檢測出對冰酒香氣有重要貢獻的3-甲硫基丙醛及菠蘿酮等之前未報道過的冰葡萄酒中重要的香氣活性物質[9]。 這些研究豐富了對冰葡萄酒中香氣化學成分的認識并對冰葡萄酒風味輪廓的解析奠定了基礎。

然而，常規的一維氣相色譜經常出現樣品中色譜峰重疊的現象并影響定性結果的準確性。 相對于一維氣相色譜，全二維氣相色譜具有更高的分辨率、靈敏度以及峰容量，已廣泛用于復雜體系樣品的分離分析[10]。 國外已經將全二維氣相色譜大量的用于酒精飲料（如葡萄酒[11]、伏特加[12]、啤酒[13]、利口酒[14]等）、奶制品[15]、茶[26]等的風味成分的剖析，而國內也已有應用于白酒[17]、露酒[18]、醋[19]、中藥[20]、龍井茶[21]等揮發性成分分析的報道。 但目前利用全二維氣相色譜對冰葡萄酒的研究還鮮有報道。 因此作者采用全二維氣相色譜-飛行時間質譜法（comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC × GC-TOFMS）對冰葡萄酒中揮發性成分進行鑒定，這不僅為后續深入研究冰葡萄酒揮發性風味輪廓的化學組成及香氣呈香機理提供了技術支撐，也為進一步改善冰葡萄酒品質提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

威代爾冰葡萄酒：煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司產品；C5-C30 正構烷烴：天津光復精細化工研究所產品。

1.2 儀器與設備

全二維氣相色譜-飛行時間質譜系統（Agilent 7890N 氣相色譜）：美國 Agilent 公司產品；KT-2001冷噴調制器：美國Zoex 公司產品；Pegasus 4D 飛行時間質譜儀：美國Leco 公司產品。

2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭、固相微萃取裝置：美國Supelco 公司產品；B11-2 型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司產品；B150/7.5 × 15 mm 磁力攪拌子：山東新華公司產品；電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品。

1.3 方法

頂空固相微萃取[9，17]：取 8 mL 冰葡萄酒樣品置于20 mL 頂空樣品瓶中，加入3 g 氯化鈉及攪拌子。萃取溫度50 ℃，樣品平衡5 min，萃取45 min，轉速250 r/min。萃取結束后進樣，將萃取頭置于GC 進樣口（250 ℃）解析附 5 min。

氣相色譜條件：色譜柱：一維色譜柱DB-FFAP（60 m × 0.25 mm ID，0.25 μm），二維色譜柱 Rxi-17Sil MS（1.1 m × 0.25mm ID，0.25 μm）。 色譜條件：進樣口溫度250 ℃，以不分流模式進樣。 一維柱溫箱升溫程序：起始溫度 45 ℃保持 2 min，以 4 ℃/min 的速率升溫至230 ℃并保持15 min。 調制器調制時間4 s，熱調制時間為 1 s，調制補償溫度為 20 ℃。 二維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫至250 ℃并保持5 min。以高純氦氣作為載氣，恒流模式，流量：1 mL/min。

飛行時間質譜條件：采用EI 離子源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電壓控制70 eV。檢測器采集質量數范圍35～400，采集頻率100 spectrum/s，電壓控制1 430 V。 數據由LECO 公司Pegasus 4D工作站采集。

數據處理：利用儀器自帶ChormaTOF 軟件對采集的數據進行解析，色譜峰的峰寬分別設為24 s 和0.2 s，自動識別信噪比大于200 的色譜峰后進行自動積分解卷積和質譜庫（mainlib，Wiley 9 和replib）比對，進一步通過保留指數（保留指數根據C5-C30計算得出）定性并剔除烷烴類等無明顯風味貢獻及胺類等主要呈味的化合物，選擇相似度及反相似度不小于800 的化合物作為最終鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 威代爾冰葡萄酒揮發性成分定性分析

基于全二維氣相色譜與飛行時間質譜聯用的方法，共在威代爾冰葡萄酒中檢測到953 個色譜峰，如圖1 所示。

圖1 威代爾冰葡萄酒GC × GC-TOFMS 分析一維及二維總離子流圖Fig. 1 GC × GC -TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of Vidal icewine

通過Pegasus 4D 工作站對質譜庫的檢索結合保留指數比對，共定性了其中的253 種香氣化合物，其中包括酯類53 種，醇類40 種，芳香族化合物39 種，萜烯類 35 種，醛酮類 25 種，呋喃類 21 種，酸類12 種，硫化物9 種，內酯類9 種，其他雜環化合物 10 種（圖 2）。 相較于一維 GC-MS 對冰葡萄酒香氣的分析[4-9，22]，GC × GC-TOFMS 表現出更好的分離效果。 例如，在威代爾冰葡萄酒中檢測到的2-糠酸乙酯、β-環檸檬醛和γ-戊內酯一維出峰時間均為1696 s，但在二維上（出峰時間分別為 8.4、15.1 s 和17.9 s）能夠很好的分離得到3 個單獨的色譜峰。

圖2 威代爾冰葡萄酒鑒定出化合物種類及數目Fig. 2 Classification of volatile compounds qualified in Vidal icewine

在鑒定出的揮發性成分中，酯類、醇類及芳香族化合物占所有化合物的52%。 酯類在葡萄酒中主要呈果香，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯等呈香蕉菠蘿等熱帶水果的香氣。 除飽和脂肪鏈酯類外，還檢測到丙烯酸丁酯、2-己烯酸乙酯、9-癸稀酸乙酯等不飽和脂肪酸酯。 醇類也是葡萄酒中重要的風味化合物，如順-3-己烯醇通常表現出青草的清香。 芳香族中苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等均在葡萄酒中表現出花香，同時檢出的百里香酚、愈瘡木酚、4-乙基愈瘡木酚、 丁香酚等可提供煙熏煙草的香氣。

萜烯類化合物主要來源于用于釀酒的葡萄中，是葡萄酒一類香氣品種香的重要組成[23]。 作者共檢測到35 中萜烯類化合物（表1）。 王蓓等[7]利用攪拌棒吸附萃取結合一維氣-質聯用在威代爾冰葡萄酒中檢測到24 種萜烯類化合物Ma 等[9]通過GC-OMS 在威代爾冰葡萄酒中共檢測到11 種萜烯。 作者鑒定出的 3-p-薄荷烯、 月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-羅勒烯、 胡椒酮、cis-冬青油醇等化合物均未在基于一維氣-質威代爾冰葡萄酒揮發性成分檢測中有過相關報道。 3-p-薄荷烯、胡椒酮在葡萄酒中主要呈現薄荷的清香，月桂烯呈天竺葵和藥香，水芹烯呈水果和薄荷的香氣[24]，但這些香氣化合物在冰葡萄酒中的風味貢獻有待進一步研究。 β-大馬酮、玫瑰醚分別呈蜂蜜和花香，在冰葡萄酒模擬液中閾值分別為 1.05 μg/L、0.09 μg/L[25]，這兩種化合物被報道對冰葡萄酒香氣具有重要貢獻[8-9]。 TDN（1，1，6-三甲基-1，2-二氫萘）在葡萄酒中呈現汽油味，是雷司令葡萄酒中的典型香氣特征，王蓓等[7]關于威代爾冰葡萄酒香氣成分的分析中也曾檢測到該化合物。

含硫化合物其低閾值及獨特的香氣特征使其成為現今食品風味研究的一個熱點。 大多數的揮發性硫化物被認為是異嗅化合物，但也有部分硫化物對食品的風味特征具有重要作用。 據報道，糠硫醇是芝麻香型白酒中呈現其獨特芝麻香氣的關鍵化合物[17]。目前冰葡萄酒中關于硫化物的報道還較少，本研究在威代爾冰葡萄酒中檢測到了9 種硫化物，分別是二甲基硫、甲硫醇、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醛、2-噻吩甲醛、4-甲基-5-乙烯基噻唑、2-甲硫基乙酸乙酯、 順-2-甲基-4-丙基-1，3-氧硫雜環己烷、3-乙硫基丙醇。 其中3-甲硫基丙醛在冰葡萄酒中主要表現為煮土豆的香氣特征，并且對冰葡萄酒整體香氣感知具有顯著影響[9]。 二甲基硫表現為白菜、蘆筍、玉米和糖漿的香氣。 這些硫化物在冰葡萄酒中的具體貢獻和作用目前還并不明晰，是否對冰葡萄酒的香氣起修飾作用或是增加冰葡萄酒的復雜性，這些問題均有待進一步研究。

表1 威代爾冰葡萄酒中的萜烯類化合物Table 1 Terpenes in Vidal icewine

續表1

2.2 威代爾冰葡萄酒揮發性成分相對含量

根據定性出的化合物的出峰時間及峰面積繪制氣泡圖（圖3），氣泡的大小表示峰面積的大小，由圖可知，酯、醇、酸、芳香族化合物峰面積較高，而大多數呋喃、醛酮、內酯、硫化物、萜烯等峰面積均較低。 其中相對含量（峰面積占總化合物峰面積比例）高于 0.5%的化合物有 31 種 （表 2），包括乙酸、己酸、異丁醇、正己醇、1-丁醇、1-丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊醇、3-辛醇、1，2-丙二醇、順-3-己烯醇、2，3-丁二醇、1-庚醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、糠醛、乙醛、3-羥基-2-丁酮、苯甲醛、2，4-二叔丁基苯酚、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、4-萜品醇、脫氫芳樟醇、橙花醇氧化物。 其大部分為酯類和醇類，還包括3 種萜烯化合物，這些化合物構成了冰葡萄酒揮發性組分的主體，可能為冰葡萄酒提供馥郁的果香、花香。 Ma 等[9]通過重組缺失實驗發現菠蘿酮和3-甲硫基丙醛對威代爾冰葡萄酒焦糖的香氣具有重要影響，說明香氣化合物對葡萄酒整體香氣的貢獻并不完全取決于其含量。 同時，萜烯、硫化物等痕量化合物具有較低的閾值，因此，進一步通過確定痕量化合物的含量并結合閾值等探究其對冰葡萄酒香氣的貢獻及價值，能夠更全面深入的了解冰葡萄酒的風味輪廓。

圖3 威代爾冰葡萄酒中揮發性化合物分布Fig. 3 Scatter plot of volitale compounds in Vidal icewine

表2 相對面積分數 （峰面積占化合物總峰面積比例） 高于0.5%的香氣化合物Table 2 Aroma compounds in Vidal icewine with relative peak area over 0.5%

續表2

3 結 語

采用頂空固相微萃取結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜法分析了威代爾冰葡萄酒揮發性成分，共定性了其中的253 種香氣化合物，其中，共檢測到35 種萜烯和9 種含硫化合物。 3-p-薄荷烯、月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-羅勒烯、胡椒酮、cis-冬青油醇等萜烯化合物均未在一維氣-質威代爾冰葡萄酒揮發性成分檢測中有過相關報道。 同時，對香氣化合物相對含量進行了分析，其中相對面積分數（峰面積占總化合物峰面積比例）高于0.5%的香氣化合物有31 種，這些化合物可能是形成冰葡萄酒香氣的重要組成部分。 但由于香氣化合物對葡萄酒風味的貢獻不僅取決于化合物的含量，也受其閾值的影響。 一些低閾值的痕量化合物如萜烯、硫化物等也可能會對冰葡萄酒香氣具有重要影響，因此這些化合物對冰葡萄酒香氣的貢獻有待結合精確的定量分析進行進一步的研究。