超聲波對雞骨蛋白酶解產物的影響及機理研究

萬 婕，張 慜 *，劉亞萍

（1. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 廣東嘉豪食品有限公司，廣東 中山 528400）

雞骨架是雞肉類加工過程中的副產品，是所有畜禽骨肉中蛋白質含量最高的原料，蛋白質質量分數可達16.3%，與等量雞胸肉相似。鮮雞骨架質量占整雞質量的比例約為20%～22%，大致由71%的雞骨，22%的雞骨肉及6%的雞皮構成。 新鮮雞骨中含有豐富的營養素，尤其是蛋白質和礦物質，此外鮮骨內含有大量骨髓，主要由水分、粗蛋白質、粗脂肪和微量元素等物質構成[1]。 目前，工業生產上對雞骨架的利用還存在利用途徑少、產品價值低等問題，其主要經過粉碎烘干后作為寵物飼料，甚至直接丟棄[2]。

隨著科學技術的進步，食品加工、設備制造等技術的發展給骨類食品的產業化發展帶來了新的機遇，鮮骨加工產業的原料利用率和產品附加值有所提高，研究表明，骨蛋白酶解后釋放的氨基酸及多肽具有如下特點：加工性能提高，表現在酶解產物的溶解性、吸水性、保水性、乳化性、起泡性及持油性等方面[3，4]；功能性顯著，膠原多肽具有降血壓[5]、抗氧化[6]、促進皮膚膠原代謝等生物活性與功能[7]；風味增強，骨蛋白經酶解后，具有肉的特殊鮮味與香味，可作為肉味香精的前體，通過后期的美拉德反應可制備出各種風味的香精調味料[8，9]。 因此，探究雞骨架的深加工技術和應用，提高其產品附加值，對于充分利用低值蛋白資源具有重要意義。

近年來，有不少研究探討和報道了低值畜骨的綜合利用，其主要是利用蛋白酶酶解低值蛋白，實現低值蛋白源的高值化。 為了提高其酶解速率，一些研究者探索將部分新技術引入其中。 超聲波屬于一種彈性機械波[10]，其頻率范圍在 2×105～2×109Hz之間，在介質中傳播時，可能產生熱效應、機械效應和空化效應等，其中空化作用被認為是影響超聲波在液體介質中反應速度和產率的主要原因。 空化作用可引起多種次級效應，如湍動效應、微擾效應、聚能效應等[11]，這些效應能夠改變蛋白質的構象和特性，強化提取過程、加速反應進程。 超聲波在反應過程中產生的氣泡經過擠壓破裂，能在瞬間產生較強的機械剪切力，對液體介質中的大分子產生機械性斷鍵作用，從而促使更多親水基團的暴露，有利于底物與酶的結合，提高蛋白質的水解程度[12-14]。

作者以雞骨架為原料，采用Alcalase 堿性蛋白酶和Flavourzyme 風味蛋白酶水解雞骨蛋白，以水解度、多肽含量等作為測試指標，研究超聲波處理應用于雙酶分步酶解雞骨蛋白，探討不同超聲條件對雞骨蛋白的酶解效果的影響，并針對其結果進行機理初探。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：雞骨架，超市購買，冷凍貯藏保存備用。

Alcalase 蛋白酶、Flavourzyme 蛋白酶：諾維信公司產品；甲醛溶液、三氯乙酸、氫氧化鈉、硫酸銅、牛白蛋白、溴化鉀等試劑均購置于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

2-16PK 型高速冷凍離心機：Sigma 公司產品；JY98-3D 超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司產品；UV2600 型紫外分光光度計：Techcomap 公司產品；FA1004 型電子分析天平：上海舜寧恒科學儀器有限公司產品； 實驗室pH 計Starter 3100：奧豪斯儀器（上海）有限公司產品；8S-1型磁力攪拌器：江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠產品；SSW-420-2S 型電熱恒溫水槽：上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；真空冷凍干燥機：作者所在實驗室設計組裝。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞骨蛋白酶解液的制備方法 將雞骨架解凍后清洗除去多余的血漬，去除雞皮及油脂，用粉碎機粉碎成雞骨泥，將雞骨泥與去離子水以1∶2 的質量比混合，充分攪拌后，經過110℃ 30 min 高溫高壓預處理，調節溫度和pH 值，酶解總時間為3 h，酶解完畢后沸水浴滅酶10 min，4 500 r/min 下離心15 min，過濾除去懸浮物與碎骨渣，即得酶解液。

酶解過程中采用超聲波輔助酶解的處理方式，即酶解雞骨蛋白的同時進行超聲處理，超聲功率分別為 200、400、600、800、1 000 W，超聲工作時間/間歇時間2 s/2 s，超聲總時間分別設置為 20、40、60、80 min。

雙酶分步酶解的具體操作過程為：先用NaOH溶液和稀鹽酸調節雞骨泥勻漿的pH，首先調節pH值至8.5，向其中添加質量分數為0.2%的堿性蛋白酶，攪勻，55℃下恒溫酶解1.5 h 后；再將pH 值調節至7，向其中添加質量分數為0.2%的風味蛋白酶，攪勻，50℃下恒溫酶解1.5 h，制得酶解液。

圖1 超聲波輔助酶解裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of ultrasound-assisted enzymolysis equipment system for chicken bone

1.3.2 水解度的測定 采用中性甲醛滴定法，即甲醛滴定出氨基氮質量分數 （具體參見國標 GB/T 5009.39-2003 中所述方法），凱氏定氮法測定出總氮質量分數 （具體參見國標 GB 5009.5-2010 中所述方法），兩者的百分比記為水解度。

1.3.3 多肽質量濃度的測定 采用雙縮脲法[15]測定多肽含量，以牛白蛋白（BSA）作為標樣，分別配置成0.5、1、2、3、4 mg/mL 的溶液，取 2 mL BSA 溶液與 3 mL 雙縮脲試劑均勻混合，靜置 30 min 后，于 540 nm 下，測定標樣的吸光度值，并繪制標準曲線。 樣品中多肽質量濃度測定時，取2 mL 的多肽酶解液，加入等體積的體積分數10%三氯乙酸，均勻混合后于4℃、4 000 r/min 高速冷凍離心20 min 得到上清液，取上清液，按照標準曲線測定方法，測定出相應的吸光度值，按以下公式計算多肽質量濃度。

式中：A 為吸光度值，n 為稀釋倍數。

1.3.4 電子舌分析 取酶解液70 mL，分別倒入電子舌專用測試杯中，使液面低于刻度線0.5～1.0 mm，機器自動測試4 次，分析時取后3 組實驗的平均值，并轉化為各味覺的響應值數值再輸出。 響應值差異越大表明差異越大，正值表明該味覺比對照組強，負值則相反。

1.3.5 氨基酸組成測定 用10 g/dL 三氯乙酸等體積稀釋，放置1 h，保證溶液體系中TCA 終質量分數為5%，雙層濾紙過濾后，取1 mL 澄清濾液于1.5 mL離心管內，10 000 r/min 下離心 15 min，后取 400 μL上清液于液相樣品瓶內，置于氨基酸分析儀上測定。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 采用溴化鉀（KBr）壓片法制片后置于配有DTGS 檢測器的IS 10 型傅里葉紅外光譜儀上進行檢測。

將酶解液凍干后磨粉，再放入瑪瑙研缽中磨為細粉，加入適量的KBr 攪磨均勻，然后壓片待測。

2 結果與分析

2.1 超聲作用對酶解產物水解度及多肽含量的影響

由圖2 可知，隨著超聲功率的增加，雞骨蛋白酶解液的DH 及其多肽含量均呈現先上升后下降的變化趨勢。 超聲波功率為200～600 W 時，雞骨蛋白的 DH 有顯著提高（P＜0.05），且在 600 W 時達到最大值，為17.99%，當超聲波功率超過600 W 時，雞骨蛋白的DH 開始下降，1 000 W 時下降至14.13%；而超聲功率為200～800 W 時，雞骨蛋白酶解液的多肽質量濃度呈上升趨勢，且在800 W 時達到最大值2.91 mg/mL，1 000 W 時酶解液的多肽質量濃度下降至2.73 mg/mL。這可能是因為，雞骨蛋白的空間結構在適當功率的超聲波作用下會發生改變，蛋白質內部的活性部位暴露出來，與酶更好的結合，此外，超聲波的振蕩作用可以使酶與底物的碰撞幾率增大，促進二者的結合，從而提高酶解產物的DH。 但當超聲波功率過大時，蛋白分子的活性部位、蛋白酶的分子構象均會被損傷，導致酶解產物DH 的下降[11]。

圖2 超聲功率對雞骨蛋白酶解液多肽質量濃度及水解度的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the peptides content and DH of chicken bone hydrolysate

圖3 表示的是超聲處理時間對雞骨蛋白酶解產物特性的影響。 隨著超聲時間的延長，雞骨蛋白酶解液的DH 及多肽含量同樣呈現先上升后下降的變化趨勢，這與超聲功率所述規律一致。 當超聲時間為30 min 時，DH 達到24%，多肽質量濃度達到2.14 mg/mL，此后，延長時間DH 及多肽質量濃度反而下降。 這可能是因為超聲時間適宜時，超聲改變了蛋白質結構，加大了酶與底物的結合速率和產物的釋放速率[13]，從而促進了酶解過程的進行。然而隨著超聲時間的延長，超聲的空化作用和擾動作用有可能使已游離的蛋白質分子重新聚合，形成大分子物質，底物分子構象的改變進而使其對酶解的促進作用減弱[16]。

圖3 超聲時間對雞骨蛋白酶解液多肽質量濃度及水解度的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic time on the peptides content and DH of chicken bone hydrolysate

由于酶解過程中同時存在著兩個過程：蛋白降解成肽和氨基酸；多肽被進一步降解成小分子肽和氨基酸。 兩個過程同時存在并產生“競爭”關系，最終產物中肽的含量取決于誰在“競爭”占得優勢。 如果蛋白降解成肽的速度快于肽降解成氨基酸的速度，那么肽的質量濃度則增加，若肽釋放成氨基酸的速度快于蛋白質降解成肽的速度，則水解產物中的肽質量濃度降低。 由圖2～3 可知，超聲作用可能會促進蛋白質降解為多肽及多肽進一步降解為氨基酸的過程。

表1 電子舌傳感器檢測不同超聲功率下的雞骨蛋白酶解液響應值Table 1 Senor outputs of chicken bone hydrolysate obtained by the electronic tongue at different ultrasonic power

2.2 超聲作用對雞骨蛋白酶解液滋味的影響

表1 和表2 所示，在一定的超聲強度和時間內，酶解液的滋味增強。 以酶解液的苦味響應值來看，隨著超聲波功率的增強和超聲時間的延長，苦味的變化趨勢呈現先增大后減少的趨勢，這基本與超聲對酶解液DH 的影響趨勢相同，而鮮味的規律趨勢與苦味大致相反。 研究表明，影響酶解液苦味的主要是苦味肽而不是游離氨基酸[17]。 有學者認為[18]，DH 持續增大，苦味肽濃度增高，酶解產物的苦味越來越強，當水解增大到一定程度，苦味肽被水解成小分子肽和游離氨基酸，它們難以滿足苦味形成的條件，所以酶解產物的苦味強度反而降低。 與苦味不同的是，酶解產物的鮮味主要受酶解過程中鮮味氨基酸的影響，所以呈現相反的趨勢。

表2 電子舌傳感器檢測不同超聲時間下的雞骨蛋白酶解液響應值Table 2 Senor outputs of chicken bone hydrolysate obtained by the electronic tongue at different ultrasonic time

由圖4～5 可以看出，在最適超聲條件（800 W，30 min）下會引起苦味值增強，鮮味值下降，但就酶解液中兩者的閾值來看，鮮味值遠遠大于苦味值，且鮮味肽對苦味具有遮蔽作用[19-20]，繼續增強超聲強度雖然會使苦味值下降，鮮味值上升，但會引起酶解液的水解度及多肽含量下降。

圖4 雞骨蛋白酶解液在不同超聲功率下的苦味值和鮮味值Fig. 4 Bitterness and umami values of chicken bone hydrolysate at different ultrasonic power

圖5 雞骨蛋白酶解液在不同超聲時間下的苦味值和鮮味值Fig. 5 Bitterness and umami values of chicken bone hydrolysate at different ultrasonic time

2.3 超聲作用對雞骨蛋白酶解液氨基酸的影響

從表3 中可以看出不同處理方式的雞骨蛋白酶解產物的氨基酸組成和總量的差異，雖然色氨酸沒有測出，但必需氨基酸（包括組氨酸）占到了總氨基酸質量分數的40%以上，其中對照組比例（沒有加入超聲波進行輔助酶解）為49.51%，超聲波處理組的比例為51.52%。 酶解過程中，雞骨蛋白被逐漸分解成小分子肽和游離氨基酸，這些游離氨基酸包括鮮(甜)味氨基 酸 ，如 Glu、Asp、Ser、Thr、Gly、A1a等，苦味氨基酸，如 Phe、Val、Leu、Ile、Tyr、His、Arg、Lys 等，這些呈味氨基酸的含量和所占比例會影響酶解產物風味的形成。 由表3 中可以看出，經過超聲處理后，鮮味氨基酸和苦味氨基酸質量分數均有所提高，雖然苦味氨基酸質量分數的增加（尤其是苯丙氨酸、亮氨酸）有可能增添酶解產物的不愉悅風味，但由于苦味氨基酸的呈味閾值遠遠高于鮮味氨基酸，所以對酶解液呈味評價的負面影響降低。

表3 酶解產物的氨基酸組成Table3 Amino acid composition of hydrolysate from chicken bone %

2.4 超聲作用對雞骨蛋白結構影響的探究

由圖6 比較可得，雞骨蛋白在酶解前和酶解后的吸收峰出現了較大的差異，主要表現在：3 300 cm-1附近的酰胺A 帶（表征N-H 伸縮振動）、3 100 cm-1附近的酰胺B 帶 （被認為是酰胺Ⅱ帶的一次泛頻，費米共振）、1 660 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶 （表征C=O伸縮振動）、1 570 cm-1附近的酰胺Ⅱ帶（表征N-H 面內彎曲振動和C-N 伸縮振動）以及1 300 cm-1附近的酰胺Ⅲ帶（表征C-H 伸縮振動和N-H 面內彎曲振動）。 另外，對比圖6 中酶解液有無超聲處理得到的吸收峰值（EH 和EHUS）可知，超聲處理組使得其吸收峰值藍移，其原因可以由酰胺 A 帶（3400～3440 cm-1）藍移現象為例進行解釋：酰胺A 帶是 N-H 或 O-H伸縮振動的吸收峰，超聲處理破壞了蛋白分子間的氫鍵，而N-H 基團的分子肽段參與了氫鍵形成，所以造成藍移現象[21]。

圖6 雞骨蛋白及其酶解產物結構分析Fig. 6 The infrared spectrogram of chicken bone and the hydrolysate from chicken bone

為進一步探究超聲處理對其結構的影響，圖7對上述4 種樣品光譜圖中的酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）進行曲線擬合。酰胺Ⅰ帶對于蛋白質二級結構的研究具有重要意義，其主要對與肽鍵有關的氫鍵敏感。 有研究表明，超聲波的機械作用和空化作用會破壞蛋白質的網絡結構，打亂蛋白質分子不同化學鍵之間的聯系。 表4 顯示，超聲處理會使雞骨蛋白緊密的α 螺旋結構打開，其質量分數由未處理前的30.71%降為處理后的23.86%，這與黃丹丹等人[21]研究的超聲預處理使金槍魚皮膠原蛋白α 螺旋降低的變化趨勢一致。 這可能是因為超聲波使得蛋白質分子間的氫鍵斷裂，蛋白分子活性位點被更多的暴露，從而使得酶解產物的DH 和活性肽段釋放效率得到提高。

圖7 雞骨蛋白及其酶解產物的酰胺I 帶曲線擬合Fig. 7 Curvefitted results of amide I bands

表4 雞骨蛋白的二級結構質量分數分析Table 4 The secondary structure of chicken bone

3 結 語

超聲波處理有助于促進雞骨架的水解，超聲輔助雞骨蛋白水解的最適條件為：超聲功率800 W，超聲時間30 min，此條件下，DH 可達24%。 氨基酸和電子舌分析表明，超聲處理使得酶解液中鮮味氨基酸含量提升，鮮味增強。 蛋白質結構分析表明，超聲會破壞蛋白質分子的網絡結構，使其活性位點被更多的暴露，從而提高了酶解過程中的DH 和活性肽段的釋放效率。

研究結果表明，超聲波處理雖然可以提升酶解產物的多肽含量及氨基酸含量，但提升幅度較小。超聲處理在提高水解度的同時也會使苦味增強，但相較于鮮味，苦味響應值較小且呈味閾值較高，所以其負面影響有限。