牛蒡多酚超聲輔助酶法提取工藝及抗氧化活性

馬艷弘 ，孟 勇 ，崔 晉 ，張宏志 ，曹培杰 ，孟 超

（1. 江蘇省農業科學院 農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2. 徐州世緣食品有限公司，江蘇 徐州 221723）

牛蒡（Arctium lappa L.）又名大力子、蒡翁菜、牛菜等，是公認的食藥同源性蔬菜。 年蒡含蛋白質、多種氨基酸、微量元素、維生素等，還含有菊糖、綠原酸、牛蒡苷、膳食纖維、多酚等生物活性成分[1-3]，具有清除氧自由基，提高人體免疫力等多種保健功效[4-6]，其營養和經濟價值高，開發應用前景廣闊。

目前國內外對牛蒡的研究主要集中在牛蒡苷、木脂素、菊糖等物質的檢測、分析，分離和純化及其功能鑒定等方面[7-9]。 多酚是牛蒡生物保健功能的主要物質基礎之一[10-12]，其提取方法包括溶劑提取、酶法輔助提取、微波輔助提取、超聲提取等方法。 采用超聲輔助酶法提取活性物質的提取時間短、提取效率高、而且產物易純化，已廣泛應用于花色苷、蛋白質、多糖等物質的高效制備[13-15]，但有關牛蒡多酚超聲輔助酶法提取的研究鮮見報道。 作者采用超聲輔助纖維素酶法提取牛蒡多酚，優化其提取工藝并探討提取物的抗氧化活性，為拓寬牛蒡加工途徑、延長產業鏈、實現牛蒡多酚的產業化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡：徐州世緣食品有限公司提供。 牛蒡清洗干凈后置于恒溫干燥箱60℃干燥至恒重，粉碎過篩，低溫保藏備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海源葉生物科技公司產品；羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測定試劑盒：南京建成生物工程研究所產品；苯酚、無水乙醇、檸檬酸、鹽酸、氯化鉀等試劑為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

KQ-2500E 超聲波機：昆山禾創儀器公司產品；真空冷凍干燥機：美國Thermo 公司產品； RE5220型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠產品；D-8 紫外分光光度計：南京菲勒儀器有限公司產品；MJ-BL15U11破壁攪拌機：廣東美的電器制造有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡多酚提取工藝 牛蒡粉稱重，加入乙醇溶液，置于450 W 功率下進行超聲處理，然后按比例加入纖維素酶，恒溫提取一段時間，4 500 r/min離心 15～20 min，分離上清，將沉淀再提取 1 次，2 次提取所得上清即為多酚提取液。 濃縮提取液，通過大孔樹脂AB-8 進行純化，經乙醇溶液洗脫、濃縮，冷干，即得牛蒡多酚。

1.3.2 總酚的測定 福林酚比色法測定多酚質量分數[16]，以沒食子酸為標品制標曲，分別加入5 mL蒸餾水，1 mL FC 試劑和3 mL 質量分數7.5% Na2CO3溶液，45 ℃水浴加熱 90 min 后，在波長 760 nm 處測吸光度，得到沒食子酸質量濃度與吸光度的回歸方程：y=0.005 3x - 0.015 2（R2=0.998 9），據此標曲計算牛蒡多酚質量分數（按沒食子酸計），再按照公式（1）計算其多酚得率Y。

式中：Y 為多酚得率，（mg/g）；C 為多酚質量濃度，（mg/mL）；V 為提取液的總體積，（mL）；m 為牛蒡粉質量，（g）。

1.3.3 單因素試驗設計 分別考察不同乙醇體積分數（30 %、40 %、50 %、60 %、70 %）、不同液料體積質量比（5、10、15、20、25 mL/g）、不同超聲波時間（3、6、9、12、15 min）、不同纖維素酶質量濃度（0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL）、不同酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）、不同酶解時間（30、45、60、75、90 min）等 6 個因素對多酚提取率的影響，根據結果確定適宜的提取條件。

1.3.4 Box-Behnken 試驗設計及響應面分析 采用Box-Behnken 設計方案，在單因素試驗的基礎上，以乙醇質量分數 （A）、 纖維素酶質量濃度/（mg/mL）（B）、酶解時間/min（C）、酶解溫度/℃（D）為考察因素，以牛蒡多酚得率為響應值，利用Design-Expert 8.05 軟件優化工藝參數。 因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素和水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5 牛蒡多酚抗氧化活性分析[17-18]

1）牛蒡多酚對DPPH 自由基清除能力測定 配置0.05 mg/mL 的DPPH 自由基溶液，取不同體積的多酚溶液，加去氧水補足1 mL，分別加入5 mL DPPH溶液，混合均勻后避光反應30 min，用分光光度計分別測定517 nm 處的吸光度值A1，5 mL DPPH溶液與1 mL 無水乙醇混合后測得的吸光度值A0，5 mL無水乙醇與1 mL 多酚溶液混合后測得的吸光度值A2。 按照公式（2）計算 DPPH 自由基清除率。

式中：A1為樣品管吸光度值；A2為對照管吸光度值；A0為空白管吸光度值。

2）牛蒡多酚抗超氧陰離子自由基能力測定 按照試劑盒說明書，分別取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多酚溶液及同質量濃度VC 溶液，測定550 nm 處的吸光度值。 對照組用無水乙醇代替樣品，按照式（3）計算抗超氧陰離子自由基活力單位。

式（3）中：A1為樣品管吸光度值；A2為對照管吸光度值；A0為標準管吸光度值。

3）牛蒡多酚清除羥自由基能力測定 按照試劑盒說明書操作，分別取500 μL 不同質量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）的多酚溶液和 VC 溶液，測定550 nm 處的吸光值。 按照式（4）計算羥自由基清除率。

式中：A1為試驗管吸光度值；A0為對照管吸光度值。

2 結果與分析

2.1 牛蒡多酚提取單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對牛蒡多酚提取量的影響 由圖1 可知，乙醇體積分數在30%～50%之間，隨著乙醇體積分數的提高，多酚提取率逐漸提高，在乙醇體積分數達到50%時，多酚的提取率達到最大值23.78 mg/g；乙醇體積分數在50%～60%之間，多酚得率變化平緩；乙醇體積分數大于60%，多酚得率隨著質量分數提高反而下降。 這是由于高體積分數提取溶劑會引起細胞蛋白質變性，間接影響多酚溶出，最終導致了得率的降低[19]。因此選擇乙醇的適宜體積分數為50%。

圖1 乙醇體積分數對多酚得率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.2 液料體積質量比對牛蒡多酚提取量的影響由圖2 可知，多酚得率會隨液料體積質量比的增加而逐漸增大，在20 mL/g 時，提取率達到峰值25.52 mg/g，之后再增大液料體積質量比，多酚得率變化平緩，表明20 mL/g 的液料體積質量比即可使多酚溶出達到平衡，由此將20 mL/g 確定為牛蒡多酚的最佳液料體積質量比。

圖2 液料體積質量比對多酚得率的影響Fig. 2 Effect of solid to liquid radio on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.3 超聲時間對牛蒡多酚提取量的影響

圖3 可見，3～6 min 范圍內多酚得率隨著超聲時間延長而提高，到6 min 時，提取率達到最大（29.68 mg/g），這是由于 6 min 內，超聲的空化效應隨時間的延長而增強，細胞破壞程度增大，從而導致多酚溶出、得率提高；超過6 min 后多酚得率開始下降，是由于長時間的超聲波作用引起了多酚的共價鍵斷裂進而引發了多酚的降解，因此，確定適宜的超聲時間為6 min。

圖3 超聲時間對多酚得率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.4 纖維素酶量對牛蒡多酚提取量的影響 由圖 4 可見，在 0.5～1.0 mg/mL 添加范圍內，隨著纖維素酶用量的加大，多酚得率也明顯提高，當酶用量為1.0 mg/mL 時，多酚得率達到最大值39.03 mg/g。之后繼續提高酶的用量，多酚得率反而降低。 表明適量纖維素酶的添加有利于破壞牛蒡的細胞壁結構，增強多酚的溶出效率，但是酶用量過多，會導致溶劑粘度增高、阻塞細胞內含物的溶出通道，從而導致其提取率的下降。

圖4 纖維素酶質量濃度對多酚得率的影響Fig. 4 Effect of cellulase concentration on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.5 酶解溫度對牛蒡多酚得率的影響 由圖5可知，酶解溫度在45～50 ℃之間，多酚得率隨酶解溫度的升高而升高，在酶解溫度達到50 ℃時達到峰值38.05 mg/g； 而多酚得率在55～60 ℃之間則基本趨于穩定；超過60℃后，多酚得率反而下降。 表明溫度過高會使酶蛋白變性，酶活性降低，從而導致多酚提取率降低。 由此確定牛蒡多酚的適宜酶解溫度為50℃。

圖5 酶解溫度對多酚得率的影響Fig. 5 Effect of cellulase reaction temperature on polyphenols yield from burdock

2.1.6 酶解時間對牛蒡多酚提取量的影響 從圖6可以看出，酶解時間在30～75 min 之間，酶解時間越長，多酚得率越高，在75 min 時多酚得率達到最大（39.71 mg/g），大于75 min 后多酚提取率反而下降。這是由于適宜的反應時間能夠促使底物和酶接觸充分，進而提高了牛酚得率。 由此可確定75 min 為牛蒡多酚的最佳酶解時間。

圖6 酶解時間對多酚得率的影響Fig. 6 Effect of cellulase reaction time on polyphenols yield from burdock

2.2 牛蒡多酚提取條件響應面優化結果

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗 根據Boxbehnken 的中心組合設計原則，以多酚得率為響應值，優化牛蒡多酚的提取工藝。 結果見表2。 利用Design Expert8.05 軟件對表中數據進行分析，得到響應值對幾個自變量的回歸方程為：

Y=41.21-0.21A+1.75B-0.40C+0.29D-0.53AB-1.13AC+1.13AD+0.99BC+0.50BD+1.28CD-0.55A2-2.571B2-1.46C2-1.00D2

表2 Box-Behnken 實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

由方差分析結果表3 可知，該回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），失擬項（P=0.092 8）不顯著，表明試驗值與預測值高度相關模型與實驗擬合良好，該模型可以反應牛蒡多酚得率的預測與分析[20]。表3 還反應了4 個自變量對響應值多酚得率的影響程度，其影響大小排序依次為纖維素酶質量濃度（B）＞酶解時間（C）＞酶解溫度（D）＞乙醇體積分數（A），其中因素C 對多酚得率影響顯著（P＜0.05），因素 B 和 AC、AD、BC、CD 的交互作用對多酚得率的影響極顯著（P＜0.01）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

2.2.2 牛蒡多酚提取量響應面分析與優化 圖7反映了兩兩因素間的交互作用對牛蒡多酚提取量的影響情況。 曲面越陡，表明變量對多酚得率影響越大[21]。 由圖可見，除乙醇體積分數與酶質量濃度（AB）、酶質量濃度與酶解溫度（BD）的交互作用對提取量的影響不顯著（P＞0.05）外，乙醇體積分數與酶解時間（AC）、乙醇體積分數與酶解溫度（AD）、酶質量濃度與酶解時間（BC）、酶解溫度與時間（CD）的互作效應對牛蒡多酚得率的影響極顯著 （P＜0.01）。經軟件分析，得到的最佳提取參數為：乙醇體積分數43.68%、纖維素酶質量濃度1.24 mg/mL、酶解時間79.81 min、酶解溫度50.56 ℃，此條件下牛蒡多酚得率為41.65 mg/g。經綜合考慮，修正為：乙醇體積分數45%、纖維素酶質量濃度1.25 mg/mL、酶解時間80 min、酶解溫度50 ℃。 經驗證，此條件下多酚提取率為41.33 mg/g，實測值與預測值相對偏差在0.76%左右，證明該模型可用于預測牛蒡多酚提取狀況。

2.2.3 超聲波輔助纖維素酶法與其他提取方法的比較 比較超聲輔助酶法提取方法、 超聲提取、酶法提取方法對牛蒡多酚提取量的影響，結果發現3種方法的多酚得率分別為 41.33、29.67、33.03 mg/g，超聲輔助酶法提取的多酚得率比其他2 種方法分別提高了39.30 %、25.13 %。 這是由于一方面纖維素酶可破壞牛蒡細胞壁結構，促使多酚外溢；另一方面，超聲波的空化效應和振動作用，也能促使牛蒡細胞破裂，導致多酚從細胞中溶出；同時，短時間的超聲處理還能夠促進酶分子空間構象發生變化、加速底物與酶的接觸，從而增強纖維素酶活力、提高酶解效率[22-24]。

圖7 各因素交互作用影響牛蒡多酚提取量的響應面圖Fig. 7 Response surface plot showing the effects of ethanol concentration, cellulase concentration,cellulase reaction temperature, and time on the yield of polyphenols from burdock

2.3 牛蒡多酚抗氧化活性分析

2.3.1 牛蒡多酚對DPPH 自由基的清除作用 如圖8 所示，牛蒡多酚的DPPH 自由基清除率隨其質量濃度的提高而逐漸增強，當質量濃度為0.5 mg/mL時，對DPPH 自由基的清除率達最大（55.66%），與同質量濃度VC 溶液對 DPPH 自由基的清除率（55.81%）相比并無差異，表明牛蒡多酚具有很強的DPPH 自由基清除能力。

圖8 牛蒡多酚的DPPH 自由基清除能力Fig. 8 DPPH radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

2.3.2 牛蒡多酚的抗超氧陰離子活力 如圖9 所示，牛蒡多酚的抗超氧陰離子自由基能力隨著多酚質量濃度增大而增強，但是略低于同質量濃度VC的抗超氧陰離子活力。

圖9 牛蒡多酚的抗超氧陰離子自由基能力Fig. 9 Superoxide anion radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

圖10 牛蒡多酚的羥自由基清除能力Fig. 10 Hydroxyl radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

2.3.3 牛蒡多酚對羥自由基的清除作用 由圖10可示，牛蒡多酚對羥自由基的清除率隨著多酚質量濃度提高而增強，具有明顯的量效關系。 但牛蒡多酚對羥自由基的清除效果明顯低于同質量濃度的VC。

3 結 語

以多酚提取率為指標，在單因素試驗基礎上通過響應面分析法優化了牛蒡多酚超聲輔助酶法提取工藝，建立的牛蒡多酚預測模型為Y= 41.21-0.21A+ 1.75B- 0.40C+ 0.29D- 0.53AB- 1.13AC+1.13AD + 0.99BC + 0.50BD + 1.28CD - 0.55A2-2.571B2- 1.46C2-1.00D2，最優提取條件為：乙醇體積分數45%、液料體積質量比20 mL/g、450 W 超聲功率下超聲處理6 min，纖維素酶質量濃度1.25 mg/mL、酶解時間80 min、酶解溫度50 ℃。 此條件下牛蒡多酚的提取量最大，達41.33 mg/g，比超聲波輔助法和纖維素酶法分別的多酚得率分別提高了39.30%、25.13%。

通過檢測牛蒡多酚的DPPH 自由基清除能力、抗超氧陰離子自由基能力、 羥自由基清除能力發現，所提牛蒡多酚具有較強的抗氧化活性，其對DPPH 自由基的清除作用最強，對羥基自由基的清除作用較弱。