白藜蘆醇多不飽和脂肪酸酯的合成

周林芳 ，江 波 ，李淑華

（1． 食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2．江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122；3．江蘇工程職業技術學院，江蘇 南通 226007）

白藜蘆醇是一種天然多酚，是植物為防御機械損傷、真菌感染或紫外線照射等而產生的[1]。 目前至少有34 科、69 屬，100 種不同的植物可產生白藜蘆醇[2]。 雖然國內外的研究表明白藜蘆醇具有多種藥理活性[3-8]，但由于其結構中存在3 個酚羥基，其穩定性較差，容易受到光和熱等因素的影響而被破壞；分子中3 個羥基的存在，使其脂溶性減弱；且臨床研究也表明白藜蘆醇在體內的生物利用度低[9]，大部分的白藜蘆醇在肝臟和腸上皮細胞中被代謝成葡萄糖醛酸苷化和硫酸酯化的形式[10]，并失去了藥理活性[11]。 目前已經有研究集中在白藜蘆醇的衍生物上，如與同樣具有藥理活性的羧酸進行酯化，形成組合化合物，不僅提高了白藜蘆醇的穩定性，而且能更好發揮兩種物質的作用。

多不飽和脂肪酸 （Polyunsaturated fatty acids，PUFAs），如亞油酸、亞麻酸、DHA 等，具有降低血液膽固醇的作用，在預防心血管疾病方面具有特殊的功效[12]，臨床上一直是治療高脂血癥和動脈粥樣硬化的有效藥物[13]，被稱為“血管清道夫”，人體一旦缺乏會引起機體生理失調而導致多種疾病的發生[14]。但由于PUFAs 中多個雙鍵的存在，極易被氧化而失效，因而需要抗氧化劑進行保護。 白藜蘆醇和PUFAs 的結合，一方面可以提高白藜蘆醇的親脂性、細胞穿透性和生物利用度[15]；而且由于PUFAs易于氧化，與白藜蘆醇的結合有助于限制其自動氧化，防止脂質氧化產生的有害影響。 另一方面，用PUFA 對白藜蘆醇進行酯化是一種很好的掩蓋其羥基極性作用的方法，從而降低白藜蘆醇生物轉化或氧化降解的速度。 此外，酚類分子中結合PUFA 可提高親脂介質中酚類化合物的抗氧化性能。 根據病理研究結果，兩者之間具有協同效應[15]。

作者采用化學法合成了白藜蘆醇和亞麻酸、花生四烯酸以及DHA 等多種多不飽和脂肪酸的酯化產物，采用質譜、紅外、氫譜、碳譜等確認產物結構，該研究為開發白藜蘆醇的酯類衍生物提供參考，也為進一步研究其酯類衍生物的性質及應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

白藜蘆醇、α-亞麻酸、花生四烯酸、DHA、氘代氯仿、氘代乙腈：上海阿拉丁生化科技有限公司產品；草酰氯、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（DCM）、三氟乙酸（TFA）、石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸、丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司產品；乙腈（色譜純）：美國Tedia 天地試劑公司產品；薄層層析硅膠板（GF254）：青島海洋化工有限公司產品。

1.2 主要儀器與設備

傅里葉紅外光譜儀（Bruker TENSOR27）：布魯克光譜儀器公司產品；Agilent Technologies 1200 Series 液相色譜系統，Agilent Technologies 6224 精確質量飛行時間質譜系統，Agilent DD2 400-MR 核磁共振波譜儀：安捷倫科技有限公司產品；Waters Prep LC 4000 Preparative Chromatography System 制備液相：沃特世科技有限公司產品； 熔點儀WRS-1B：上海精密儀器儀表有限公司產品；臺式三用紫外分析儀：上海一科儀器有限公司產品。

1.3 實驗方法

由于反應主要原料白藜蘆醇和幾種不飽和脂肪酸都不太穩定，以下實驗均在氮氣保護下進行。

1.3.1 白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應 三口瓶中，加入亞麻酸和18 mL DCM，冰水浴攪拌，滴加草酰氯和2 滴DMF，室溫反應3 h。 另一三口瓶中，加入白藜蘆醇、11 mL DCM、三乙胺，冰水浴攪拌，滴加上述酰氯反應液反應2 h （TLC 監控反應至原料點較淡），加入 50 mL 0.5 mol/L HCl 攪拌 10 min 分液，有機相經50 mL 水洗 1 次分液，再用50 mL 0.5 mol/L 碳酸氫鈉攪拌10 min 分液，最后用50 mL 水洗1 次，加無水硫酸鈉干燥30 min，過濾，40 ℃濃縮至干，粗品經高效制備液相分離，得兩個亞麻酸酯產品，BL-亞麻酸酯 1 （120 mg）和 BL-亞麻酸酯 2 （80 mg），收率10%。

表1 白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應主要物料Table 1 Main materials used in the reaction of resveratrol with linolenic acid

1.3.2 白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應 三口瓶中，加入相應脂肪酸和2 mL DCM，冰水浴攪拌，滴加草酰氯和1 滴DMF，室溫反應3 h。 另一三口瓶中，加入白藜蘆醇、2 mL DCM、三乙胺，冰水浴攪拌，滴加上述酰氯反應液反應2 h （TLC 監控反應至原料點較淡）。 反應完畢后，加入5 mL 0.5 mol/L NaOH 攪拌10 min 分液，洗去可能產生的部分單取代以及雙取代產物。 有機相經5 mL 飽和食鹽水洗滌1 次分液，加無水硫酸鈉干燥30 min，過濾，40℃濃縮至干，粗品經柱層析分離（PE∶EA=4∶1），得液態油狀產物白藜蘆醇花生四烯酸酯 15 mg，收率12.6%，液態油狀產物白藜蘆醇DHA 酯12 mg，收率10.2%。

表2 白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應主要物料Table 2 Main materials used in the reaction of resveratrol with arachidonic acid/DHA

1.4 分析方法

最終反應產物的結構由質譜、紅外光譜、核磁共振氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）確定。反應過程中用TLC 和HPLC 跟蹤分析。

1.4.1 TLC 條件 白藜蘆醇與亞麻酸的反應：展開劑為 V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=2∶1，UV254 nm；白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 的反應：展開劑為V（石油醚）∶V （乙酸乙酯）∶V （丙酮）=5∶1∶0.7，UV254 nm（原料和產物均可用高錳酸鉀顯色）。

1.4.2 HPLC 條件 白藜蘆醇與亞麻酸反應混合物的 HPLC 條件為：柱溫 25 ℃；流量 1 mL/min，檢測波長 230 nm，進樣量 2 μL。 流動相：A 為體積分數0.1% TFA-CH3CN，B 為體積分數 0.1% TFA-H2O，梯度洗脫程序為：0 min 10∶90；10 min 100∶0；12 min 100∶0；20 min 10∶90。 純產物的梯度洗脫程序為：0 min 50∶50；10 min 90∶10；20 min 90∶10；23 min 50∶50。 樣品用乙腈溶解，過膜。

1.4.3 制備液相條件 白藜蘆醇與亞麻酸反應后兩個產物的分離采用高效制備液相，條件為：Waters Prep LC 4000 Preparative Chromatography System，柱溫：25 ℃；流量：10 mL/min；檢測波長：230 nm；進樣量：0.5 mL。 流動相為 V（乙腈）∶V（水）=90∶10。 樣品用乙腈溶解，過膜。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應產物鑒定

白藜蘆醇與亞麻酸成酯反應后，反應液取樣經HPLC 檢測發現圖中有兩個大峰。 反應混合物經高效制備液相分離后得到兩個酯化產物，分別以BL-亞麻酸酯1 和BL-亞麻酸酯2 表示。 熔點測定結果顯示BL-亞麻酸酯1 的熔點為128℃，BL-亞麻酸酯2 的熔點為 145 ℃。

酯化產物的結構分別經質譜、 紅外、1H-NMR、13C-NMR 確定。

2.1.1 質譜鑒定 白藜蘆醇的相對分子質量為228，亞麻酸的相對分子質量為278，如果成單酯化、二酯化和三酯化產物的相對分子質量分別為488、748 和 1 014。 從質譜結果來看，m/z=506 為單酯化產物的準分子離子[M+NH4]+，分子式計算結果也顯示，兩個產物的匹配分數最高達99.65%和98.86%對應的分子式均為C32H44NO4，即2 個產物分子的分子式為C32H40O4，因此可初步確定兩產物為單酯化產物。

2.1.2 紅外光譜鑒定 圖1 為白藜蘆醇與亞麻酸反應產物的紅外光譜圖。 從兩圖中看到，1 726 cm-1和1 750 cm-1出現強吸收帶及1 163 cm-1和1 152 cm-1的最強峰，說明分別為酯羰基C=O 的伸縮振動特征峰以及酯中C-O-C 伸縮振動吸收峰，可以判斷兩分子中均存在酯基；另外，兩圖中3 405 cm-1和3 272 cm-1分別出現較寬吸收峰，說明白藜蘆醇中還有游離羥基未參與反應；兩圖的指紋區也比較清晰，676 cm-1和679 cm-1為順式烯氫面外變形振動峰；965 cm-1和955 cm-1為反式烯氫面外變形振動峰。 從紅外譜圖結合質譜結果可以判斷產物應該為白藜蘆醇單亞麻酸酯，下面通過核磁譜圖進一步確證。

圖1 白藜蘆醇與亞麻酸反應產物的紅外光譜圖Fig. 1 Infrared spectra of resveratrol and alpha-linolenic acid reaction product

2.1.31H-NMR 和13C-NMR 鑒定 圖 2 和圖 3 分別為BL-亞麻酸酯1（氘代乙腈）和BL-亞麻酸酯2（氘代氯仿）的1H-NMR 和13C-NMR 譜圖。圖 2 中各個質子信號的歸屬都已標出。

因白藜蘆醇與亞麻酸的單酯化產物只有兩種，從兩個產物的氫譜圖2 中可以看出，BL-亞麻酸酯1 的低場區明顯比BL-亞麻酸酯2 要復雜，可以判斷出BL-亞麻酸酯1 為3 位酯化產物，而BL-亞麻酸酯2 為4'位酯化產物。 進一步經過質子歸屬，與之前的判斷一致。

以上結果與NMR 譜圖數據庫（www.nmrdb.org）預測結果吻合，通過以上分析，可以確證合成的產物1 為亞麻酸-3-白藜蘆醇酯，產物2 為亞麻酸-4'-白藜蘆醇酯。

2.2 白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應產物鑒定

白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 成酯反應后，過柱后均得到油狀產物。

2.2.1 質譜鑒定 從白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA酯化產物的質譜結果來看，m/z=1 104 和m/z=1 176分別為兩個三酯化產物的準分子離子 [M+NH4]+，分子式計算結果也顯示，2 個產物的匹配分數最高達98.1%和99.57%對應的分子式分別為C74H106NO6和C80H106NO6，即 2 個產物分子的分子式分別為C74H102O6和C80H102O6，因此可初步確定兩產物均為三酯化產物。

圖2 白藜蘆醇與亞麻酸反應產物的核磁共振氫譜Fig. 2 1H NMR spectra of resveratrol and alpha-linolenic acid reaction product

圖3 白藜蘆醇與亞麻酸反應產物的核磁共振碳譜Fig. 3 13C NMR spectra of resveratrol and alpha -linolenic acid reaction product

2.2.2 紅外光譜鑒定 圖4 為白藜蘆醇與花生四烯酸/DHA 酯化產物的紅外光譜圖。 從圖中同樣可以判斷出2 個分子中都存在酯基； 另外3 000 cm-1以上沒有寬峰，說明白藜蘆醇中的3 個羥基都已參與反應。 從紅外譜圖結合質譜結果可以判斷兩產物均為三酯化產物，下面通過核磁譜圖進一步確證。

圖 4 白藜蘆醇與（a）花生四烯酸/（b）DHA 反應產物的紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of resveratrol and （a）arachidonic acid/（b）DHA reaction product

2.2.31H-NMR 和13C-NMR 鑒定 圖 5～6 分別為白藜蘆醇和花生四烯酸/DHA 的1H-NMR 和13CNMR 譜圖（溶劑均為氘代氯仿）。圖5 中各個質子信號的歸屬都已標出。

以上結果與NMR 譜圖數據庫（www.nmrdb.org）預測結果吻合，通過以上分析，可以確證合成的產物分別為三花生四烯酸白藜蘆醇酯和三DHA 白藜蘆醇酯。

2.3 反應機理

圖5 白藜蘆醇與(a)花生四烯酸/(b)DHA 反應產物的核磁共振氫譜Fig. 5 1H-NMR spectra of resveratrol and （a）arachidonic acid/（b）DHA reaction product

圖6 白藜蘆醇與(a)花生四烯酸/(b)DHA 反應產物的核磁共振碳譜Fig. 6 13C-NMR spectra of resveratrol and （a）arachidonic acid/（b）DHA reaction product

采用化學法成功合成了白藜蘆醇和3 種多不飽和脂肪酸的酯化產物，包括亞麻酸、花生四烯酸和DHA。 由于所用脂肪酸位阻較大，直接酯化困難，故先把脂肪酸制成相應的酰氯，再與白藜蘆醇反應成酯。

2.3.1 羧酸的酰化 酰氯是最活潑的酰基化試劑，在一些羧酸不能進行或進行非常緩慢的反應中將羧酸制成酰氯使反應活性和產率大大提高。 目前，制備酰氯的方法最常用的酰化試劑有氯化亞砜、草酰氯、三氯化磷、五氯化磷、三光氣等，而草酰氯是一種較為活潑的酰化試劑，它比氯化亞砜更綠色環保，可用于酸類和胺類物質的酰化。

把羧酸和草酰氯室溫下攪拌混合，反應比較平緩。 一旦加入少許DMF 催化后，就有氣泡產生，反應比較劇烈。 DMF 加劇了反應進程，起到重要的催化作用，反應機理如下：

當草酰氯和DMF 合用時，其氯化劑的實際形式其實為上式的Vilsmeier-Haack 試劑，該試劑活性大、反應迅速、選擇性好，以及能有效的結合反應中生成的HCl 等優點，故可作為良好的羧羥基置換試劑[16]。

生成的Vilsmeier-Haack 試劑再與羧酸反應生成相應的酰氯以及DMF，因此反應中的DMF 起到催化的作用，其用量只需要催化量即可。 在整個酰化反應中，因草酰氯不僅對空氣敏感，且遇到潮氣會發生分解放出HCl，遇水會劇烈分解，因此反應中應嚴格控水，所用溶劑均應重蒸除水。

2.3.2 酰氯的醇解成酯 通過上步把羧酸制成相應的酰氯后，反應能力增強，適于位阻大的醇（酚）羥基酰化。 且白藜蘆醇和多不飽和脂肪酸之間的酯化，酚羥基由于受芳環的影響，使酚的親核性降低，其酰化比醇要困難，需要用較強的酰化劑。 酰氯的性質雖然沒有酸酐穩定，但因作者所用脂肪酸的酸酐難以制備，不宜采用酸酐法，因此將羧酸制備成酰氯后再與白藜蘆醇反應。 由于反應中有氯化氫釋放出來需要中和，所以本反應在三乙胺（Et3N）存在下進行。 三乙胺作為縛酸劑，以消除反應中的氯化氫，有利于醇解反應的進行。 總的反應歷程經過兩步，一是酰基化合物和親核試劑（白藜蘆醇）的加成反應得四面體中間體，二是四面體中間體的消除反應成酯。 反應歷程如下[17]：

3 結 語

多酚和多不飽和脂肪酸是兩類天然化合物，在流行病學研究中發現它們都對健康有益。 許多體外和體內實驗都報道了這兩類代謝產物具有生物活性。 因此，在過去的十幾年間，把這兩類化合物通過化學結合生成多酚不飽和脂肪酸酯，在很多領域中受到了重視。 如親水性藥物與多不飽和脂肪酸結合可有助于增加極性酚類藥物的親脂性、細胞穿透性和生物利用度。 另外，把多酚和一些本身具有生物活性的羧酸結合成酯，作為一種新型的、更安全的組合化合物，可以同時釋放多酚和羧酸。 因此，白藜蘆醇多不飽和脂肪酸酯也是增加其生物利用度的一種替代方法，可用于藥品、食品、保健品和化妝品中，對該領域的研究目前還在起步中。

用化學法，利用草酰氯把3 種多不飽和脂肪酸制成酰氯后再與白藜蘆醇反應以制備相應的酯，采用質譜、紅外、氫譜、碳譜等測試手段首次確認了四種白藜蘆醇多不飽和脂肪酸酯的結構。 作者為開發白藜蘆醇的相關酯類產品提供了參考，也為進一步探索其酯類產品的性質及應用提供了一定的依據。