反式肉桂醛對副溶血性弧菌的抑制作用

郭 都，張文婷，郝旭昇，尹術華，郭 曉，鄭楊洋，于海波，石 超

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一種無芽孢、無莢膜、有鞭毛、能運動的短桿或弧桿狀的革蘭氏陰性細菌，屬于弧菌科弧菌屬[1]。 副溶血性弧菌是一種嗜鹽菌，可在含鹽量為0.5%～8%的環境中正常生長[2]，廣泛分布于近岸海水、海底沉積物和海產品中[3]，其在海產品中的檢出率夏季（7～9 月份）可高達50%以上[4]，其中蝦類、魚類和貝類受副溶血性弧菌污染尤其嚴重[5]。

近年來，隨著經濟的發展和人民生活水平的不斷提高，海鮮食品逐漸進入內陸，產銷量逐年增加，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件也呈逐年上升趨勢[6]。 副溶血性弧菌引起的食源性疾病一般為急發病，潛伏期2～24 h。 人體感染副溶血性弧菌后，輕者會出現以惡心、嘔吐或腹痛為主要癥狀的急性腸胃炎[7]，重者可能會脫水、休克、昏迷甚至死亡[8]。據統計，在東南亞國家，約50%的腸胃炎是由副溶血性弧菌引起的；在美國、歐洲地區，副溶血性弧菌也是危害公眾健康的主要致病菌之一，其感染發生率逐年增加[9]；在中國，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在數量上已超過沙門氏菌中毒案例（2012年報道），副溶血性弧菌已成為首要的食源性致病菌[10]。由此可見，副溶血性弧菌引起的食物污染在世界范圍內嚴重危害著公眾的健康安全。

為降低海產品中副溶血性弧菌的污染風險，目前應用的控制措施主要包括輻照保鮮、 氣調保鮮、化學防腐劑保鮮以及生物保鮮等技術[11-13]。 輻照保鮮和氣調保鮮雖然能夠很大程度地保留食品的營養和香味，但其缺點在于對技術及工廠方面安全防護措施的要求高，實際應用成本也較高[14-15]；化學防腐劑雖然有良好的抑菌效果，但易使菌體產生耐受性，而且有可能改變食品的自然風味和質構，往往具有潛在毒性，不被消費者接受[16]。 因此尋求安全、有效的控制海產品中副溶血性弧菌的方法具有重要意義。 近年來，植物源活性物質因具有天然、安全和營養等優點而受到廣泛關注[17]，越來越多的研究者將目光投向天然植物源活性物質抑制食源性致病菌[14，18]。

肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分，主要存在于肉桂樹皮，它在自然界中的天然存在形式為反式肉桂醛（C9H8O，trans-cinnamaldehyde，TC）[19]。 反式肉桂醛已被美國食品藥品監督管理局 （Food and Drug Administration，FDA） 列為公認安全的食品成分（Generally Recognized as Safe，GRAS）。 反式肉桂醛作為一種食品添加劑，已被應用于多種食品中，如口香糖、冰淇淋、糖果和飲料等，它還可以與山毛櫸堅果殼粉混合成商品化的肉桂粉，用于面包、蛋糕及其他烘焙產品[20]。 據報道，反式肉桂醛具有抗癌、抗炎和治療糖尿病等多種生理功能[21]，并且其已被證實對多種致病菌如金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌O157：H7 和沙門氏菌具有良好的抑制作用[22-24]，但目前反式肉桂醛對海產品中副溶血性弧菌的抑制作用及抑菌機理卻尚未研究。

因此，作者以副溶血性弧菌為檢測對象，首先通過測定反式肉桂醛對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度，評價其抑菌效果；其次通過測定反式肉桂醛對副溶血性弧菌生長曲線、生長動力學參數、細胞膜完整性和細胞形態的影響，探究其抑菌機理；最后通過構建副溶血性弧菌污染的鮮蝦模型，評價反式肉桂醛對鮮蝦中副溶血性弧菌的控制作用，旨在為反式肉桂醛作為一種植物源抑菌劑用于控制海產品中副溶血性弧菌的污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基、試劑與鮮蝦

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）標準菌株ATCC 17802、ATCC 33847：購于美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）；副溶血性弧菌分離菌株 241、245、247、249：由香港理工大學食物安全及科技研究中心分離自鮮蝦。

NaCl 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基：胰蛋白胨15 g、植物蛋白胨 5 g、氯化鈉 30 g、瓊脂 15 g，加蒸餾水定容至1 L，加熱煮沸至完全溶解后，121 ℃高壓滅菌15 min 備用；3 g/dL NaCl 胰酪胨大豆肉湯培養基（3 g/dL NaCl Tryptone Soya Broth，3 g/dL NaCl TSB）：胰蛋白胨17 g、植物蛋白胨3 g、氯化鈉30 g、磷酸氫二鉀2.5 g、葡萄糖2.5 g，加蒸餾水定容至1 L，加熱煮沸至完全溶解后，121 ℃高壓滅菌15 min備用。

反式肉桂 醛 （trans-cinnamaldehyde，HPLC ≥99%）：購于美國 Sigma 試劑公司；LIVE/DEAD?BacLightTM細菌活性檢測試劑盒：購于賽默飛世爾科技公司；二甲基亞砜（DMSO，HPLC≥99.5%）：購于天津市科密歐化學試劑有限公司；試驗所用其他試劑：均為國產分析純。

鮮蝦：購于陜西省咸陽市楊凌示范區盛世陽光超市，鮮活低溫條件運回實驗室，平均體長（7.0±0.5）cm，平均體重（4.44±0.25） g。

1.2 儀器與設備

微生物全自動生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司產品；低溫冷凍離心機5804R：德國Eppendorf公司產品；多功能微孔板檢測儀Microplate Readers Spectra Max M 2：美國Molecular Devices 公司產品；激光共聚焦顯微鏡Nikon A1：日本Nikon 公司產品；場發射掃描電鏡S-4800：日本Hitachi 公司產品。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與菌懸液制備 將-80 ℃保存的副溶血性弧菌菌株（ATCC 17802、ATCC 33847、分離菌 241、245、247、249） 劃線于 3 g/dL NaCl TSA 培養基，經37 ℃恒溫培養12 h 后，分別挑取單菌落接種于3 g/dL NaCl TSB 肉湯，置于 37 ℃恒溫搖床（120 r/min）培養 12 h。 隨后，將菌懸液離心（4 ℃ 8 000 g，離心10 min），使用無菌磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Solution，PBS，pH 7.2）清洗菌體兩次，離心參數設置同前。 隨后使用PBS 溶液調整菌懸液600 nm處吸光度值（OD600nm）為0.5（菌懸液濃度約108CFU/mL）備用。

1.3.2 反式肉桂醛對副溶血型弧菌最小抑菌濃度的測定 試驗參照 Yousef 等（2013）[25]的方法，略有修改。 在 24 孔板的第一個孔中加入 1 mL、45～55 ℃經高溫高壓滅菌的3 g/dL NaCl TSA 培養基，將反式肉桂醛加入至第一個孔，充分吹打混勻，使其質量濃度為 200 μg/mL。 隨后使用 3 g/dL NaCl 的 TSA 在24 孔板中逐步稀釋，使反式肉桂醛終質量濃度分別為 140、100、70、50、35 和 25 μg/mL （每孔終體積為0.5 mL，DMSO 質量分數為0.5%）。 以不添加反式肉桂醛的3 g/dL NaCl TSA 培養基 （含質量分數0.5%DMSO）為陰性對照組，以添加卡那霉素（0.1 mg/mL）的3 g/dL NaCl TSA 培養基為陽性對照組。待瓊脂冷卻凝固后，分別取1.3.1 中制備的菌懸液2 μL 接種至24 孔板各孔中央，將樣品置于37 ℃培養箱，24 h后觀察。試驗將經過24 h 培養后肉眼觀察無明顯菌落生長的最低反式肉桂醛質量濃度作為最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。

1.3.3 反式肉桂醛對副溶血型弧菌生長曲線的影響 試驗選取副溶血型弧菌ATCC 17802 進行后續研究。 參照 Silvaangulo 等（2014）[26]的方法，將 1.3.1中制備的副溶血性弧菌ATCC 17802 菌懸液離心 （4 ℃8 000 g，離心 10 min），使用無菌 3 g/dL NaCl TSB肉湯將菌體清洗兩次。 隨后使用3 g/dL NaCl TSB調整菌液OD600nm=0.5，并使用3 g/dL NaCl TSB 肉湯將菌液稀釋100 倍（約106CFU/mL）。在蜂窩板每孔中加入 125 μL 菌懸液。 隨后，向蜂窩板每孔加入125 μL 使用3 g/dL NaCl TSB 肉湯溶解的反式肉桂醛溶液，使反式肉桂醛終質量濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC。 試驗設置不含反式肉桂醛的菌懸液（含0.5% DMSO）作為對照組，同時設置3 g/dL NaCl TSB 肉湯 （含0.5%DMSO）作為背景空白對照組，每組設置6 個平行。將樣品置于Bioscreen 全自動生長曲線分析儀，于37 ℃下每隔1 小時測定24 h 內各孔吸光度值，繪制生長曲線。

選取修正Gompertz 模型擬合菌株生長狀況，并表征其生長參數。 修正Gompertz 模型的表達式為：

其中，At表示在 t 時的菌液濃度；t 表示培養時間（h）；A 表示初始菌液濃度；B 表示最大的菌液濃度；μ 為指數期的相對生長速率；λ 為遲滯期 （h）；M 為菌株達到指數期所用的時間（h）；μmax為最大生長速率。 采用SPSS 20.0 軟件中的非線性回歸方法擬合A、B、μ、λ、M 和 μmax參數值。

1.3.4 反式肉桂醛對副溶血型弧菌細胞膜完整性影響的測定 反式肉桂醛對副溶血型弧菌細胞膜完整性影響的測定參照Alakomi 等（2005）[27]所采用的LIVE/DEAD?細菌活性檢測試劑盒方法。試劑盒中含有SYTO 9 和碘化丙啶 （PI） 兩種核酸染料，SYTO 9 是小分子染料，能夠進入細胞膜完整或細胞膜損傷菌并與其DNA 或RNA 結合從而發出綠色熒光[28]。PI 是大分子染料，它只能夠進入細胞膜損傷的細胞中并與其核酸結合從而使菌體染色為紅色并覆蓋SYTO 9 的綠色熒光[29]，因此紅色熒光強度比例代表細胞膜損傷菌所占比例。試驗使用0.85 g/dL NaCl 將1.3.1 中離心收集的菌體洗滌2 次，隨后加入2 mL 0.85 g/dL NaCl 使菌體重懸浮。 為獲得細胞膜完整菌和細胞膜損傷菌，分別取1 mL 上述重懸菌液于 20 mL 0.85 g/dL NaCl 溶液（活菌組）和 20 mL 體積分數70%異丙醇溶液（死菌組）中，于25 ℃培養箱培養1 h（每15 分鐘搖勻一次）。隨后使用0.85 g/dL NaCl 溶液洗滌菌體并重新懸浮，調整菌懸液OD600nm=0.5（兩組誤差不超過0.01）。 將死菌組細胞與活菌組細胞混合，使死細胞比例分別為0%、10%、50%、90%和100%作為標曲組。

在活菌組菌懸液中添加反式肉桂醛，使其終質量濃度分別為 0、MIC 和 2MIC。 將樣品在 37 ℃培養30 min 后離心（4 ℃、11 000 g，離心 1 min），隨后使用0.85 g/dL NaCl 溶液重懸浮菌體。各取樣品組、標曲組100 μL 加入到黑色96 孔酶標板中，每組 3 個平行。 將紅色熒光染料 PI （2×）、 綠色熒光染料SYTO 9（2×）和無菌水以體積比 3∶3∶1 000 混合，在黑色96 孔酶標板各孔中加入100 μL 混合染料，充分吹打混勻。 將96 孔酶標板置于25 ℃培養箱避光孵育15 min，隨后使用多功能微孔板檢測儀檢測各孔熒光強度值。 SYTO 9 染料的激發波長/發射波長為485/542，PI 染料的激發波長/發射波長為485/610。通過測定紅色熒光強度，構建細胞膜不完整細菌與其對應的紅色熒光強度的線性關系作為標準曲線。最后測定樣品組紅色熒光強度，根據標準曲線計算各組細胞膜不完整細菌百分比。

1.3.5 反式肉桂醛對副溶血型弧菌細胞膜完整性影響的觀察 參照 Gu 等（2012）[30]的方法，將 1.3.4中不同濃度反式肉桂醛（0、MIC 和2MIC）與活菌組菌懸液作用 30 min 后的菌體離心 （4 ℃、10 000 g，離心2 min），隨后使用0.85 g/dL NaCl 溶液將菌體重懸浮。 將紅色熒光染料PI（2×）與綠色熒光染料SYTO 9（2×）等體積混合，在上述菌懸液中分別加入3 μL 混合染料并輕柔混勻，避光孵育15 min。隨后，將樣品滴加于載玻片，蓋上蓋玻片，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察菌體熒光染色情況。

1.3.6 反式肉桂醛對副溶血型弧菌細胞形態的影響 為測定反式肉桂醛對副溶血型弧菌細胞形態的影響，按照1.3.1 中的方法制備菌懸液。 將添加不同質量濃度反式肉桂醛（0、MIC 和2MIC）的菌懸液置于37 ℃培養箱培養，分別在2 h 和4 h 取出，使用 PBS 溶液洗滌菌體兩次。 參照 Lv 等（2011）[31]的方法，將上述洗滌后的菌體經體積分數2.5%戊二醛溶液4 ℃固定過夜后，使用PBS 溶液和無菌水依次漂洗，在質量分數1%鋨酸溶液中固定5 h（4 ℃）后，分別使用體積分數30%、50%、70%、80%和90%乙醇脫水10min，最后使用100%乙醇脫水。 將樣品滴加至專用玻片后干燥，將玻片有序貼附于載物臺抽真空干燥后噴金，使用場發射掃描電鏡觀察細胞形態。

1.3.7 反式肉桂醛對鮮蝦中副溶血型弧菌的抑制作用 使用PBS 溶液將1.3.1 中制備的副溶血型弧菌ATCC 17802、 分離菌241 和分離菌245 菌懸液分別稀釋至約106CFU/mL，隨后將3 種菌懸液等體積混合備用。 參照孫亞軍等（2014）[32]的方法處理鮮蝦。 在無菌條件下，將鮮蝦在無菌水中清洗1 次，隨后在質量分數0.2% NaClO 消毒液中浸泡5 min，將鮮蝦在無菌水中再清洗2 次以除去殘留的NaClO。將反式肉桂醛添加至3 種菌懸液的混合菌液，使反式肉桂醛終濃度質量分數為 0%、0.1%、0.2%和0.4%，同時將鮮蝦樣品放入其中均勻混合。 隨后將鮮蝦取出置于無菌培養皿瀝干3 min 后，轉移至4 °C冰箱。分別在 0、1、2、4、6、8 h 取出鮮蝦樣品，置于含有30 mL PBS 溶液的離心管中渦旋，使鮮蝦上的菌體充分脫落。 吸取渦旋后的上清液，使用PBS 不稀釋或進行10 倍稀釋后涂布于3 g/dL NaCl TSA 培養基。 37 ℃恒溫培養24 h 后，記錄細菌總數，每組設置3 個平行。

1.4 數據處理

數據以平均值±標準差表示，使用SPSS 軟件（version 20.0，Inc.，Chicago，IL） 對數據進行統計分析，顯著性檢驗采用單因子方差分析，P＜0.05 為差異顯著（*），P＜0.01 為差異極顯著（**）。

2 結果與分析

2.1 反式肉桂醛對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度

反式肉桂醛對副溶血性弧菌的MIC 測定結果見表1。結果表明：反式肉桂醛對副溶血性弧菌標準菌株 ATCC 17802 和 ATCC 33847 的 MIC 分別為50 μg/mL 和 70 μg/mL。 可見，反式肉桂醛對ATCC 17802 的抑制效果強于ATCC 33847。反式肉桂醛對分離自鮮蝦的副溶血性弧菌菌株241、245、247 和249 的 MIC 一致，均為 70 μg/mL。 部分學者也探究了其他植物源活性物質對副溶血性弧菌的抑制作用：Direkbusarakom 等（1998）[33]研究發現番石榴與苦瓜素對副溶血性弧菌的MIC 分別為0.625 mg/mL和1.250 mg/mL；Packiavathy 等（2013）[34]測定了姜黃素對副溶血性弧菌ATCC 17802 的MIC 為0.15 mg/mL；賀怡瓊等（2016）[35]的研究表明，酸漿根莖葉提取物對副溶血性弧菌的MIC 為50 mg/mL。 通過比較已研究的植物源活性物質對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度，可以得出，反式肉桂醛對副溶血性弧菌具有良好的抑制作用。

表1 反式肉桂醛對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of transcinnamaldehyde against different strains of Vibrio parahaemolyticus

2.2 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802 生長曲線的影響

反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802 生長曲線的影響見圖1。由圖1 可知，未經反式肉桂醛處理的副溶血性弧菌 （對照組）5 h 后生長趨于穩定，開始進入穩定期。 當反式肉桂醛質量濃度為MIC時，副溶血性弧菌的生長完全受到了抑制。 質量濃度為1/2MIC 的反式肉桂醛雖沒有完全抑制副溶血性弧菌的生長，但與對照組相比，副溶血性弧菌生長延滯期增長，培養約7 h 后才開始進入指數期。1/8MIC、1/16MIC 和1/32MIC 反式肉桂醛組副溶血性弧菌的生長曲線與對照組相比無明顯差異。

本研究結果表明：經瓊脂稀釋法測定得到的最小抑菌質量濃度的反式肉桂醛（50 μg/mL），在肉湯中也能夠抑制副溶血性弧菌ATCC 17802 的生長。生長曲線試驗反映了微生物生長各個階段的菌體數量，本研究使用液體稀釋法通過測定菌懸液光密度值（OD600nm）間接反映菌體數量，也有研究采用平板計數法測定細菌在不同時間的菌落數繪制生長曲線，如 Hermans 等（2011）[36]采用平板計數法發現反式肉桂醛對空腸彎曲菌具有呈現濃度依賴性的抑制效果。 兩種方法均能反應微生物的生長規律，但與本試驗采用的比濁法相比，平板計數法雖能直接反映細菌數量，但實驗誤差較大且費時不方便。

圖1 不同反式肉桂醛濃度作用下副溶血性弧菌ATCC 17802 在含3 g/dL NaCl TSB 肉湯中的生長曲線Fig. 1 Growth curves for Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 in 3 g/dL NaCl TSB with various concentrations of trans-cinnamaldehyde

試驗通過擬合Gompertz 模型表征不同質量濃度反式肉桂醛作用后的副溶血性弧菌生長動力學參數，各擬合方程的 R2均大于 0.98，表明修正Gompertz 模型能夠較好地擬合菌株的生長狀況。 如表2 所示，與對照組相比，經各質量濃度反式肉桂醛處理后，副溶血性弧菌的生長延滯期（λ）均增加，質量濃度為1/2MIC 的反式肉桂醛使λ 由對照組的1.756 h 增加至7.420 h。 此外，不同質量濃度的反式肉桂醛使副溶血性弧菌最大生長速率（μmax）顯著減小，最大光密度值（ODmax）顯著降低，并呈現質量濃度依賴性。

2.3 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802 細胞膜完整性的影響

首先構建了不同比例的副溶血性弧菌細胞膜損傷菌與其對應的紅色熒光強度值之間的線性關系作為標準曲線（y=143.88x+298.03），結果顯示線性良好（R2=0.99）。在此基礎上研究了反式肉桂醛對副溶血性弧菌細胞膜完整性的影響，結果見圖2。未經反式肉桂醛處理的（對照組）副溶血性弧菌紅色熒光強度值為300.05±1.05，細胞膜不完整細菌比例為1.4%。 與對照組相比，當反式肉桂醛質量濃度為MIC 時，副溶血性弧菌紅色熒光強度值顯著增加，細胞膜損傷菌比例增加至8.3%（P＜0.05）。質量濃度為2MIC 的反式肉桂醛使副溶血性弧菌細胞膜損傷菌比例增加至29.9%（P＜0.01）。由此得出，反式肉桂醛對副溶血性弧菌細胞膜完整性有顯著性降低作用，且呈現質量濃度依賴性。

表2 不同反式肉桂醛質量濃度作用下副溶血性弧菌ATCC 17802 的生長動力學參數Table 2 Growth kinetic parameters of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802 with different concentrations of trans-cinnamaldehyde

細胞膜的完整性是菌體正常生長代謝的重要條件。 細胞膜完整性被破壞后，可能會導致一些重要細胞組分如蛋白質、核酸和糖類物質流出，從而影響菌體的正常生長代謝[37]。 作者通過測定LIVE/DEAD?試劑盒中所含的兩種染料 （SYTO 9 和PI）與細胞膜完整及不完整菌體核酸結合后所產生的特異性熒光來分析反式肉桂醛對副溶血型弧菌細胞膜完整性的影響。 還有一些方法也可用于測定細胞膜完整性：Diao 等（2014）[18]通過測定菌懸液 260 nm 處吸光度值 （胞內流出的核酸及蛋白質在260～280 nm 有較大吸收峰）評價不同濃度的茴香精油對志賀氏菌細胞膜完整性的破壞作用，得出質量濃度為2MIC 的茴香精油使志賀氏菌OD260nm值增加了16.64 倍。Zhou 等（2005）[38]測定了含有質量分數0.125%殼寡聚糖的變形鏈球菌培養上清液中乳酸脫氫酶及γ 谷丙轉氨酶的含量，結果菌液上清液中的這兩種胞內酶含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明殼寡聚糖使細菌明顯出現了胞內酶溢出的現象，以此評價殼寡聚糖對變形鏈球菌細胞膜完整性的破壞作用。Shi 等（2016）[39]也采用 LIVE/DEAD?試劑盒方法測定了檸檬醛對阪崎腸桿菌細胞膜完整性的影響，通過構建細胞膜完整菌比例與其對應的綠色熒光強度之間的線性關系，測定了經檸檬醛處理后的阪崎腸桿菌細胞膜完整菌所占比例。 結果表明，質量濃度為2MIC 的檸檬醛使阪崎腸桿菌細胞膜完整菌的比例顯著降低了85%（P＜0.05）。

圖2 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802 細胞膜完整性的影響Fig. 2 Effect of trans-cinnamaldehyde on the membrane integrality of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802

2.4 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802細胞膜完整性影響的觀察

試驗利用激光共聚焦成像結合熒光染色技術進行反式肉桂醛對副溶血性弧菌細胞膜完整性影響的觀察和分析，結果見圖3。

由于PI 只能透過細胞膜損傷菌，所以，當在共聚焦顯微鏡下觀察到細胞呈紅色時，則意味著菌體細胞膜的完整性遭到了破壞。 由圖3 可知，未經反式肉桂醛處理的（對照組）副溶血性弧菌幾乎全部被 SYTO 9 染為綠色（圖 3（a）），這說明對照組細菌細胞膜完整。與對照組相比，經質量濃度為MIC 的反式肉桂醛處理后，菌體呈現少量紅色熒光（圖3（b））。隨著反式肉桂醛質量濃度增加至2MIC，約30%～40%的綠色熒光被紅色熒光覆蓋，呈現橘紅色的弧桿狀形態（圖3（c））。這表明反式肉桂醛能夠降低副溶血性弧菌細胞膜完整菌的比例，并呈質量濃度依賴性，這與2.3 的測定結果相吻合。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察未經反式肉桂醛處理（a）、經質量濃度為MIC 反式肉桂醛處理（b）及2MIC 反式肉桂醛處理（c）的副溶血性弧菌ATCC 17802 細胞膜完整性Fig. 3 Confocal laser scanning microscope analysis of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802 untreated with trans-cinnamaldehyde，treated with transcinnamaldehyde at MIC and 2MIC

2.5 反式肉桂醛對副溶血性弧菌ATCC 17802 細胞形態的影響

試驗利用場發射掃描電鏡觀察反式肉桂醛對副溶血性弧菌細胞形態的影響，結果見圖4。未經反式肉桂醛處理的副溶血性弧菌細胞形態呈現弧形、桿狀、外觀飽滿、表面光滑（圖 4（a），圖 4（d））。 與對照組相比，質量濃度為MIC 的反式肉桂醛作用2 h后，副溶血型弧菌菌體呈現輕度皺縮且中心凹陷（圖 4（b））。 當反式肉桂醛質量濃度增加至 2MIC 且作用于副溶血性弧菌4 h 后，大部分菌體出現干癟皺縮（圖 4（f））。 以上結果表明，反式肉桂醛影響了副溶血型弧菌的細胞形態。

圖 4 未經反式肉桂醛作用 2 h（a）、4 h（d），經濃度為 MIC反式肉桂醛作用 2 h（b）、4 h（e），經濃度為 2MIC 反式肉桂醛作用 2 h（c）、4 h（f）后副溶血性弧菌 ATCC 17802 場發射掃描電鏡圖Fig. 4 Field emission -scanning electron micrographs of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802 untreated with trans-cinnamaldehyde for 2 h （a） and 4 h（d），treated with trans-cinnamaldehyde at MIC for 2 h （b） and 4 h （e），treated with transcinnamaldehyde at 2MIC for 2 h（c） and 4 h（f）

類似的，Liu 等 （2016）[40]通過掃描電鏡觀察發現，1.5MIC（MIC=0.625 mg/mL）和 5MIC 的二氫楊梅素（藤茶中的主要活性物質）使副溶血性弧菌菌體干癟、表面粗糙，當質量濃度增加為10MIC 時，菌體出現破裂。藍蔚青等（2014）[41]發現經殼聚糖、茶多酚和溶菌酶復合保鮮劑處理后，金黃色葡萄球菌菌體發生扭曲變形、干癟破裂的現象。張赟彬等（2015）[42]觀察了質量濃度為MIC 的肉桂醛使金黃色葡萄球菌失去了圓滑的球狀形態、使大腸桿菌菌體細胞凹陷，胞膜表面褶皺，但未使菌體溶解破裂。

2.6 反式肉桂醛對鮮蝦中副溶血性弧菌的抑制作用

為探究反式肉桂醛的實際應用效果，試驗構建了副溶血型弧菌污染的鮮蝦模型，并結合鮮蝦運輸、銷售及家庭冷藏過程中的常用溫度考慮，探究了反式肉桂醛在4 ℃對鮮蝦中副溶血型弧菌的抑制效果，結果見圖5。 在0 h 時，對照組及各質量濃度反式肉桂醛處理組的鮮蝦中副溶血性弧菌細菌總數均為 5.7。 在 1 h 時，0.1 mg/mL 和 0.2 mg/mL 反式肉桂醛使鮮蝦中的副溶血性弧菌細菌總數分別下降至4.8 和3.6，而質量濃度為0.4 mg/mL 的反式肉桂醛使細菌總數降低至檢出限以下。在8 h 時，副溶血性弧菌細菌總數經0.1 mg/mL 和0.2 mg/mL 反式肉桂醛處理后分別下降了2.2 和3.4。反式肉桂醛對鮮蝦中副溶血型弧菌的抑制作用隨反式肉桂醛質量濃度的升高而增強。

圖5 反式肉桂醛在4 ℃對鮮蝦中副溶血型弧菌的抑菌作用Fig. 5 Inhibitory effects of trans -cinnamaldehyde on Vibrio parahaemolyticus in shrimp at 4 ℃

類似的研究表明，反式肉桂醛能夠降低多種食品中的食源性致病菌的數量。Amalaradjou 等（2009）[24]證明了0.5 mg/mL 反式肉桂醛在4 ℃對復原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的抑制效果，處理10 h 后細菌總數全部降低至檢出限以下。 研究表明，當牛肉餡中大腸桿菌O157：H7 初始細菌總數為7.0 lg（CFU/g）時，0.15 mg/mL 反式肉桂醛處理牛肉餡1 d 后使牛肉餅中大腸桿菌O157：H7 細菌總數顯著降低了 3.0（P＜0.05），且呈現質量濃度依賴性[43]。

蝦類產品作為世界范圍內主要的海鮮食品，具有較高的商業價值。 但包括鮮蝦在內的海產品中的副溶血性弧菌檢出率較高，這增大了人體感染的風險，使得海產品零售產業受到了限制。 研究結果表明，反式肉桂醛能夠有效抑制鮮蝦中的副溶血性弧菌。反式肉桂醛已被美國FDA 認證為公認安全的食品成分，廣泛應用于食品領域，它有潛力作為一種天然抑菌劑應用于蝦類及其他海產品，其控制海產品中的副溶血性弧菌具有廣闊的應用前景，這對提升我國海產品質量安全水平具有較高的實際應用價值。 然而，反式肉桂醛對鮮蝦感官品質的影響需要在實際應用前進一步探討。

3 結 語

探究了反式肉桂醛對副溶血型弧菌的抑制作用機理及其對鮮蝦中副溶血性弧菌的控制效果。 結果表明：反式肉桂醛對6 株副溶血性弧菌的最小抑菌質量濃度為50～70 μg/mL，使菌體最大生長速率顯著減小，最大光密度值顯著降低。 并且，反式肉桂醛使副溶血性弧菌細胞膜完整性顯著降低并改變了菌體的形態，使菌體干癟塌陷。 反式肉桂醛對鮮蝦中副溶血性弧菌具有良好的抑菌效果，且抑菌效果隨其質量濃度增大而增強，當反式肉桂醛質量濃度為0.4 mg/mL 時在4 ℃作用鮮蝦，鮮蝦中副溶血性弧菌在1 h 全部降低至檢出限以下。綜上所述，反式肉桂醛對副溶血型弧菌有著良好的抑菌效果，其是通過使副溶血性弧菌細胞膜完整性降低，使細胞形態干癟、皺縮發揮抑菌作用的。 結合其對鮮蝦中副溶血型弧菌的抑菌效果，我們認為，反式肉桂醛有潛力作為天然抑菌劑應用于鮮蝦及其他海產品中控制副溶血型弧菌的感染。