慢性心力衰竭患者血清高遷移率族蛋白B1對調節性T細胞免疫功能及預后的影響

謝蕓 陳維平

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種人體持續存在的心力衰竭狀態，由于心肌梗死、心肌病、血流動力學負荷過重以及炎癥等造成的心肌損傷[1]。這種心肌損傷會使得人體的心肌結構以及功能發生變化，且在慢性心力衰竭的過程中，常常伴隨出現一系列的并發癥，從而對預后產生影響，其中腎功能不全是最常見的一種預后影響，被稱為心腎綜合癥[2]。近些年發現，肌少癥也是慢性心力衰竭患者的一種并發癥，由于心力衰竭患者運動能力受限，而導致骨骼肌的質量及功能障礙[3,4]。已有研究表明，60%～80%的心衰患者至少有Ⅲ以上的腎功能問題，其腎小球的過濾能力也明顯出現降低，平均過濾率從55.7 ml/min下降到43.1 ml/min，甚至更低達到30 ml/min，這嚴重影響心力衰竭患者的腎健康[5]。而肌少癥在慢性心力衰竭患者中發病率達到了19.5%[6]，因此慢性心肌炎患者的預后作用較為重要，從而不斷減少心衰患者的并發癥。目前，關于HMGB1對健康人體T淋巴細胞增殖的研究較多，然而關于慢性心肌炎患者血清中高遷移率族蛋白B1對于T細胞的免疫功能影響以及預后的研究較少，基于此本文開展此項研究，以期分析HMGB1對于心力衰竭預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月到2018年8月到我院進行就診的CHF患者50例(患病組)，選取50例同期來體檢的健康者為對照組。2組受試者的性別比、年齡等差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 受試者的人口學特征 n=50,例

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：選取0～60歲CHF患者，被確診為心力衰竭的患者滿足以下癥狀：患者勞累時氣短、端坐呼吸，易乏力、頭暈，夜間睡眠時陣發性呼吸存在困難且咳嗽，放射性癥狀表現為肺水腫、心臟擴大以及葉間積水等。

1.2.2 排除標準：進行過心臟移植手術的病患；有惡性腫瘤、感染性疾病、嚴重肝腎疾病以及甲狀腺疾病史的人群；入院時有其他重大外科手術及外傷的病患；以往有腎小球腎炎等腎病的患者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：所有受試者在清晨空腹時取外周靜脈血35 ml，5 ml置于無抗凝管中凝固，離心后提取血清于凍凝管中，并將血清于-80℃的冰箱中保存待測。血清使用前室溫下復溶后進行指標的測定。②外周靜脈血T淋巴細胞的分離培養：將上述抽取剩下的30 ml外周靜脈血加入肝素鈉抗凝劑，與Hanks液1∶1混合均勻后，按2∶1比例加入Ficoll-Hypaque淋巴細胞的分離液，500 g離心15 min后，取中間層加入5 ml的PBS洗滌后同樣轉速離心4 min，棄上層，加入2 ml的Lying solution，避光靜置10 min后再次離心；棄上層液體，重復使用PBS洗滌離心2次后使用10%的小牛血清溶液重懸細胞，使用PBS稀釋20倍后進行培養[7]。

1.3.2 酶聯免疫法檢測血清中HMGB1：采用酶聯免疫法檢測2組血清中的HMGB1水平，使用酶聯免疫試劑盒進行檢測，具體操作步驟嚴格按照試劑盒上的要求進行[8]。

1.3.3 T淋巴細胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA表達的測定：采用異硫氰酸胍一步提取法進行總RNA的提取[9]：將300 μl的變形裂解液加入EP管中，后加入2 mmol/L，pH值為4的NaAc 30 μl，再加入酚：氯仿：異丙醇(125∶24∶1)混合液300 μl，冰浴15 min后12 000 g、4℃離心20 min，取上次液體與等體積的的異丙醇混合于-20℃的冰箱中放置2 h，同樣離心條件下離心15 min，加入75%的冷乙醇1 ml再次離心10 min后，棄上層用20 μl的無RNA的酶水解后-20℃保存總RNA，并進行總RNA的定量，后將RNA逆轉錄為cDNA后保存在-20℃冰箱里。IL-2、IL-2R以及內參β-actin引物的特異性檢測[10]：首先進行BLAST的測試，后進行水浴條件下進行目的基因的PCR，97℃條件下變性反應5 min。反應完成后采用瓊脂糖凝膠電泳來收集檢測mRNA的表達量。

1.3.4 細胞培養液上清IL-2、sIL-2R濃度的檢測：采用酶聯免疫檢測法來進行細胞培養液上清中IL-2及sIL-2R蛋白濃度的檢測[11]。嚴格按照試劑盒上要求進行操作，主要操作步驟如下：首先進行標準品、抗體以及酶結合物的稀釋，將標準品及檢測樣品中加樣，室溫條件下孵育60 min后進行洗滌，洗滌完成后加入100 μl的稀釋酶結合物，再次洗滌3次后加入50 μl的底物，室溫下孵育20 min，最后加入50 μl的終止液于450 nm的波長條件下檢測OD值。

1.3.5 血清中氨基末端BNP前體的檢測：采用電化學發光免疫法檢測血清中氨基末端BNP前體的水平[12]。實驗使用試劑盒進行操作，具體操作方法嚴格按照試劑盒上說明進行。

2 結果

2.1 2組血清中HMGB1水平比較 患病組血清中HMGB1含量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清中HMGB1水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 2組別血清T淋巴細胞中IL-2及IL-2RmRNA表達 T淋巴細胞中IL-2及IL-2RmRNA表達，其中慢性心肌炎患者血清中IL-2mRNA及IL-2mRNA含量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組別血清T淋巴細胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA表達

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 2組上清IL-2、sIL-2R的蛋白濃度比較 細胞培養液上清IL-2、sIL-2R的濃度 患病組血清中IL-2及sIL-2R的蛋白含量均高于對照組，數差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組上清IL-2、sIL-2R的蛋白濃度比較

注：與對照組比較,*P<0.05

2.4 2組血清中氨基末端BNP前體含量比較 慢性心肌炎患者血清中氨基末端BNP前體的含量明顯高于健康人群，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 2組血清中氨基末端BNP前體的含量比較

注：與對照組比較,*P<0.05

3 討論

高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一種真核生物細胞核中高度保守的染色質蛋白，當釋放至核外后，做為細胞因子參與機體的炎癥反應調節中，在真核生物細胞中含量較多，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率高而得名[13]。當由于感染及組織損傷導致細胞壞死時，HMGB1即釋放；同時內毒素、促炎細胞因子激活的單核/巨噬細胞也將直接分泌高遷移率族蛋白B1[14]。分泌后的高遷移率族蛋白B1通過晚期糖基終產物受體以及其信號通路作用下，誘導腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素等炎性因子以及黏附分子發生轉錄，從而大量的炎性介質釋放[15-17]。但已有研究表明，高遷移率蛋白B1具有較好的應用前景，其對于機體的免疫調節不局限于單向促炎作用，HMGB1可與TNF-α相互誘生，從而產生雙向免疫活性的作用[18]。研究也表明，HMGB1含量與人體中的B型腦鈉肽(BPN)水平呈現正相關的作用[19]。

已有研究表明，人體血清中的HMGB1水平可用于患者的心衰診斷中，當肌體組織受損或受到病原體的刺激時，細胞會將HMGB1分泌到細胞外[20]，從而誘導肌體發生炎性反應，因此慢性心肌炎患者血清中的HMGB1含量明顯增高。研究發現，HMGB1在慢性心肌炎患者的病理中發揮著較大的作用，可做為心力衰竭的診斷指標之一，其作為真核生物細胞核內的染色質蛋白，當釋放到細胞外即成為調節機體炎癥的細胞因子[21]，在炎性反應免疫調節中扮演著重要的作用；釋放到核外的HMGB1將活化樹突狀細胞、單核細胞以及巨噬細胞等抗原呈遞細胞，從而不斷調節機體中的免疫應答反應。HMGB1還對于一些干細胞具有化學趨化效應、介質黏附分子表達等作用[22]。至今發現的關于HMGB1拮抗治療的手段已較多，有研究表明，關于膿毒癥患者與HMGB1抗炎反應中，膿毒癥的產生是由于機體促炎、抗炎失衡導致，二者交替抵抗過程中，抗炎機制占優勢并導致免疫抑制，且HMGB1治療膿毒癥小鼠的研究已被證實[23]。同時研究表明，HMGB1對人體的T細胞功能亞群從促炎免疫應答優勢轉向抗炎免疫作用，從而不斷發揮著作用，但目前關于HMGB1如何參與免疫平衡調節的具體過程，仍有待進一步的研究[24]。

研究表明，IL-2稱為“淋巴因子”，其在T淋巴細胞的增殖分化以及免疫調節中發揮著重要的調節作用[25]，而IL-2R可由細胞表面脫落為可溶性的IL-2R，并與IL-2結合，IL-2R是T細胞活化的關鍵，結合IL-2后激活T細胞，從而參與慢性心肌炎患者的T細胞免疫過程。HMGB1在機體的免疫功能中扮演著很大的作用。而本文通過研究慢性心力衰竭患者血清中的HMGB1以及T淋巴細胞中IL-2以及IL-2R蛋白的表達等，發現慢性心力衰竭患病組HMGB1比對照組HMGB1高了1.05 ng/ml；慢性心力衰竭患者血清中IL-2mRNA及IL-2mRNA含量均高于健康對照組，IL-2 mRNA及IL-2 mRNA分別高了0.210 ng/ml及0.230 ng/ml；患慢性心力衰竭的患者血清中IL-2蛋白含量為0.166 μg/L，sIL-2R的蛋白含量為2.268 μg/L，患病組血清中IL-2及sIL-2R的蛋白含量均高于對照組；患病組血清中氨基末端BNP前體為3 176.2 pg/ml，而健康對照組血清中氨基末端BNP前體為2 114.1 pg/ml，慢性心力衰竭患者血清中氨基末端BNP前體的含量明顯高于健康人群。

綜上所述，慢性心肌炎患者血清中HMGB1含量高于健康人群，其增長促進了人體中T細胞的免疫過程，促進心肌細胞的再生，而升高的HMGB1可能與心力衰竭患者不良預后相關。