百令膠囊聯(lián)合美托洛爾對冠心病伴心力衰竭患者炎癥、氧化應(yīng)激水平及血管內(nèi)皮功能的影響

夏靜 于宏梅 徐懿 陳弢 趙德強(qiáng)

冠心病是包括心絞痛、心肌梗死等類型在內(nèi)的一組疾病，臨床癥狀常表現(xiàn)為胸痛、呼吸困難、體液豬留等。2015年，全世界共有1.1億人患冠心病，890萬人因冠心病而死亡，占所有死亡人數(shù)的15.9%，是最常見的死亡原因[1]。冠心病晚期常合并心力衰竭，可對心臟及機(jī)體循環(huán)功能造成嚴(yán)重?fù)p害，是導(dǎo)致病情惡化的重要原因[2]。美托洛爾是一種β受體阻滯劑，能夠有效緩解心臟負(fù)荷，提高冠心病患者的生存率，改善患者的預(yù)后，但是美托洛爾單用可能無法使治療效應(yīng)最大化，因此常需要與其他藥物聯(lián)合使用[3]。百令膠囊是以人工蟲草菌絲干粉為主要成分的中藥，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化等功能，已在慢性阻塞性肺疾病、腎病綜合征、糖尿病腎病等患者中證實(shí)具有治療效果[4,5]。此外，百令膠囊在頑固性心率失常、病毒性心肌炎等部分心血管疾病中也可發(fā)揮保護(hù)作用[6,7]，但是其在冠心病中的應(yīng)用筆者尚未見報(bào)道。本文旨在探討百令膠囊聯(lián)合美托洛爾治療對冠心病伴心力衰竭患者炎癥、氧化應(yīng)激水平以及血管內(nèi)皮功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2018年10月我院收治的94例冠心病伴心力衰竭患者為研究對象，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組47例。對照組給予美托洛爾片治療，觀察組在美托洛爾片的基礎(chǔ)上給予百令膠囊輔助治療。收集2組患者的一般資料，包括年齡、性別、NYHA分期、冠心病病程、是否合并高血壓、糖尿病、高血脂等病史。患者均簽署知情同意書，本研究已獲倫理委員會批準(zhǔn)。2組患者在年齡、性別比、冠心病病程、NYHA分級、高血壓、糖尿病、高血脂方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組患者一般資料比較 n=47

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：冠心病和心力衰竭參照《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》和《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》進(jìn)行診斷[8]，美國紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級Ⅱ～Ⅳ級，超聲心動圖檢查左心室射血分?jǐn)?shù)<50%。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①心肌梗死或其他疾病導(dǎo)致的心力衰竭；②Ⅱ～Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯以及嚴(yán)重心動過緩；③伴有先天性心臟病、心臟瓣膜病、肝腎功能障礙、精神疾病、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤等其他疾病；④對本研究中的藥物過敏者。

1.3 治療方法 2組患者均給予常規(guī)治療方案，包括吸氧、利尿劑、洋地黃制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、硝酸酯類等。對照組患者在常規(guī)治療方案的基礎(chǔ)上給予美托洛爾片(江西南昌濟(jì)生制藥廠生產(chǎn))，口服，初始劑量6.25 mg/次，2次/d，根據(jù)病情可逐漸增加劑量，每周可增加6.25～12.5 mg/次，最大劑量不能超過100 mg/次。觀察組患者在對照組的基礎(chǔ)上給予百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn))輔助治療，口服，劑量1 g/次，3次/d。2組患者均進(jìn)行3個(gè)月的治療。

1.4 心功能 使用彩色多普勒超聲儀(江蘇佳華電子設(shè)備有限公司，JH-930)對2組患者治療前后的心功能指標(biāo)進(jìn)行檢測，包括左心室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic dimension，LVESD)。

1.5 血清學(xué)指標(biāo) 所有患者在治療前后抽取5 ml空腹靜脈血，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，留取上層血清。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)檢測血清中白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)的含量。根據(jù)丙二醛檢測試劑盒說明書(北京索萊寶科技有限公司)，使用硫代巴比妥酸法檢測血清中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量。根據(jù)一氧化氮(Nitric oxide，NO)檢測試劑盒說明書(北京索萊寶科技有限公司)，使用硝酸鹽還原酶法檢測血清中一氧化氮(Nitric oxide，NO)的含量。

1.6 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 患者治療前后抽取5 ml肝素抗凝靜脈血，加入5 ml PBS混勻，緩慢的加于10 ml 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)上方，1 500 r/min離心20 min，可見溶液分成4層：最上層的血漿、第二層為乳白色的外周血單個(gè)核細(xì)胞層、第三層為透明的分離液、最底層的紅細(xì)胞。小心的吸取第二層的外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入PBS洗滌，1500 r/min離心20 min，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 向分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞中加入100 μl的RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，充分裂解后，12 000 r/min離心5 min，對上清進(jìn)行BCA蛋白定量。取40 μg的總蛋白，加入上樣緩沖液，沸水中煮5 min。在配置的聚丙烯酰胺凝膠中上樣，電泳結(jié)束后，將目的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的牛血清白蛋白封閉2 h，加入抗TLR4抗體(英國Abcam公司，1∶500)、抗NF-κB抗體(英國Abcam公司，1∶500)、抗GAPDH抗體(英國Abcam公司，1∶3 000)，4℃孵育過夜。洗滌3次，加入山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，1∶5 000)，室溫孵育1 h，洗滌3次，滴加ECL顯色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司，Gel Doc XR+)下拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各個(gè)條帶的灰度值，將對照組治療前時(shí)目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為1.0。

1.8 血管內(nèi)皮依賴性舒張功能 參照Celemajer等[9]的報(bào)道，使用彩色多普勒超聲儀(美國惠普公司，HPsonos2500)對2組患者治療前后的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能(flow mediated dilatation，F(xiàn)MD)進(jìn)行檢測，具體步驟為：患者取仰臥位，將超聲探頭放置于肘窩上方3～7 cm處，探頭頻率為7.5 MHz，測量肱動脈的基礎(chǔ)內(nèi)徑(D0)。使用袖帶對肱動脈加壓充氣至39.9 kPa，阻斷血流5 min后放氣，1 min后測量肱動脈的內(nèi)徑(D1)。計(jì)算FMD=(D1-D0)/D0×100%。

2 結(jié)果

2.1 2組患者心功能比較 與治療前比較，2組患者LVEF升高，LVEDD和LVESD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組治療后相比較，觀察組治療后的LVEF升高，LVEDD和LVESD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者治療前后心功能比較

注：與治療前比較，*P<0.05

2.2 2組患者血清炎性因子含量比較 與治療前相比較，2組患者治療后血清中IL-6、TNF-α、CRP的含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組治療后比較，觀察組治療后血清中IL-6、TNF-α、CRP的含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者治療前后血清炎性因子含量比較

注：與治療前比較，*P<0.05

2.3 2組患者血清中氧化應(yīng)激水平比較 與治療前比較，2組患者治療后血清中MDA的含量降低，SOD的含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組治療后比較，觀察組治療后血清中MDA的含量降低，SOD的含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組患者治療前后血清中氧化應(yīng)激水平比較

注：與治療前比較，*P<0.05

2.4 2組患者血管內(nèi)皮功能比較 與治療前比較，2組患者治療后血清中ET-1的含量降低，NO的含量和FMD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組治療后比較，觀察組治療后血清中ET-1的含量降低，NO的含量和FMD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

2.5 2組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路表達(dá)比較 與治療前比較，2組患者治療后外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4和NF-κB的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組治療后比較，觀察組治療后外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4和NF-κB的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6，圖1。

表5 2組患者治療前后血管內(nèi)皮功能比較

注：與治療前比較，*P<0.05

表6 2組患者治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路表達(dá)比較

注：與治療前比較，*P<0.05

圖1 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路的表達(dá)

3 討論

冠心病是在冠狀動脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)上，發(fā)生心肌缺血、缺氧甚至壞死的一種心臟病，晚期常合并心力衰竭，是導(dǎo)致其死亡的主要原因。美托洛爾是冠心病的常用藥物，可改善患者的遠(yuǎn)期生存率，但是單獨(dú)使用往往不能發(fā)揮最大效能，常與其他藥物聯(lián)合使用[3]。百令膠囊的有效成分主要是發(fā)酵的冬蟲夏草菌絲干粉，具有與冬蟲夏草相似的藥理作用，可以人工合成，有效緩解了冬蟲夏草產(chǎn)量不足、價(jià)格昂貴的缺陷[10]。百令膠囊具有抗炎、抗氧化、抗纖維化的作用，已在腎病綜合征、慢性阻塞性肺疾病、病毒性心肌炎等疾病中證實(shí)具有確切的療效[4-6]，但是百令膠囊對冠心病合并心力衰竭是否具有治療效應(yīng)尚不清楚。

本研究，結(jié)果顯示與治療前比較，2組患者治療后LVEF升高，LVEDD和LVESD降低，表明美托洛爾可以改善冠心病合并心力衰竭患者的心功能，與其他學(xué)者的報(bào)道結(jié)果[3]一致。此外，觀察組在治療后的心功能優(yōu)于對照組，表明百令膠囊和美托洛爾聯(lián)合給藥對心功能的改善效果優(yōu)于美托洛爾。吳嵐等[6]在病毒性心肌炎誘導(dǎo)心肌纖維化的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，百令膠囊可以減輕纖維化程度，提高心功能，可能與抑制TGF-β1/MAPK/ERK信號通路有關(guān)，而本文則進(jìn)一步在臨床研究中證實(shí)了百令膠囊對心功能的改善效應(yīng)。

高水平的系統(tǒng)性炎性持續(xù)存在于冠心病患者，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞在心肌損傷處的積聚以及IL-6、TNF-α、CRP等一系列炎性因子的釋放，可進(jìn)一步加重心肌組織的局部微環(huán)境[11]。此外，外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路的活化是促進(jìn)炎癥因子分泌的上游機(jī)制。因此，本文對血清中的炎癥因子含量以及外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號通路的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與對照組治療后比較，觀察組治療后血清中IL-6、TNF-α、CRP的含量降低，外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4和NF-κB的表達(dá)降低，表明百令膠囊與美托洛爾聯(lián)合用藥在炎癥抑制方面優(yōu)于美托洛爾單獨(dú)用藥。劉春燕等[12]發(fā)現(xiàn)百令膠囊可以下調(diào)糖尿病腎病患者血清中IL-6、IL-18等炎性因子的含量，抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)，與本文在冠心病伴心力衰竭患者中的研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激失衡是冠狀動脈粥樣斑塊形成的重要機(jī)制，血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的水平與冠心病患者的病情程度密切相關(guān)，常用于反映冠心病患者的治療情況[13]。本結(jié)果顯示，與治療前比較，對照組患者治療后血清中MDA的含量降低，SOD的含量升高，表明美托洛爾具有一定的抗氧化作用；與對照組治療后比較，觀察組治療后血清中MDA的含量降低，SOD的含量升高，表明百令膠囊可以進(jìn)一步增強(qiáng)美托洛爾的抗氧化效應(yīng)。

血管內(nèi)皮損傷在冠心病的早期階段便開始出現(xiàn)，可表現(xiàn)為縮血管因子和舒血管因子表達(dá)的失衡。ET-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有縮血管作用，雖然在心肌缺血的早期可以發(fā)揮一定的心肌保護(hù)作用，但是持續(xù)的ET-1高表達(dá)可導(dǎo)致心肌重構(gòu)[14]。NO也主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可以抑制血小板黏附、聚集和活化，主要發(fā)揮舒張血管的作用[15]。本結(jié)果顯示與對照組治療后比較，觀察組治療后血清中ET-1的含量降低，NO的含量升高，表明百令膠囊可以有效改善冠心病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)失衡狀況。此外，F(xiàn)MD是反映冠心病患者血管內(nèi)皮功能的直接指標(biāo)[16]，本結(jié)果顯示2組患者在治療后的FMD均升高，而且觀察組的FMD較對照組的升高程度更大，表明百令膠囊聯(lián)合美托洛爾治療具有更好的血管內(nèi)皮功能改善作用。

綜上所述，百令膠囊可以抑制冠心病伴心力衰竭患者的炎癥和氧化應(yīng)激水平，改善血管內(nèi)皮功能，具有較好的治療效應(yīng)。