不同劑量右美托咪啶對蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期大鼠神經(jīng)功能的影響

李雪 李蔚 丁會峰 王保芝 韓建民 徐雪 曹靜 步雪靜 康靖超

蛛網(wǎng)膜下腔出血是顱腦損傷中常見的疾病之一，嚴重威脅患者的生存質(zhì)量及生命安全。有研究認為，腦缺血再灌注過程主要與脂質(zhì)過氧化反應、炎性因子、調(diào)亡及抗凋亡因子、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)等存在密切的關系[2]，而蛛網(wǎng)膜下腔出血的模型研究筆者所見較少。蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期，血凝塊聚集在蛛網(wǎng)膜下腔，不能及時被吸收，含氧血紅蛋白釋放氧自由基，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，同時釋放血管活性因子誘發(fā)一系列的反應，導致細胞結構功能破壞，最終引起血腦屏障通透性增加、脈絡叢異常、腦脊液回流障礙、腦血管痙攣。細胞凋亡反應是一種生理性的細胞死亡過程，是組織器官的保護性功能。蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生，導致該功能調(diào)節(jié)異常，正常腦組織，如：海馬、腦皮質(zhì)等部位神經(jīng)細胞過度凋亡，最終引起機體神經(jīng)功能障礙。導致神經(jīng)細胞及血管壁結構破壞。右美托咪啶(dexmedetom-idine,DEX)是一種新型的高選擇性α-2 腎上腺素受體激動劑,研究表明，在腦缺血再灌注損傷、腦出血、腦損傷等動物模型中，DEX被證明有顯著的腦保護作用[1]，在氧中毒的新生鼠模型研究中證明，DEX可以抑制氧中毒引起的神經(jīng)細胞的凋亡、炎性反應及脂質(zhì)過氧化反應，保護神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[2]。Liao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DEX可以抑制海馬、丘腦區(qū)凋亡因子的表達降低異氟烷對新生鼠記憶功能的損傷。可見，DEX對各種原因?qū)е碌哪X損傷均有保護性的作用。本研究擬從神經(jīng)行為學、病理學、形態(tài)學、炎性因子及凋亡的情況評價三種不同劑量右美托咪啶對蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期大鼠神經(jīng)功能的影響，為臨床應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠50只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：1611355，雌雄不限，3個月齡，體重250～300 g，采用隨機數(shù)字表法分為5組(n=10)：對照組(C組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(S組)、低劑量右美托咪定組(D1組)、中劑量右美托咪定組(D2組)、高劑量右美托咪定組(D3組)。

1.2 造模 采用經(jīng)寰枕膜枕大池注血法，制備大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型[4]。造模完成即刻，S組經(jīng)尾靜脈泵注1.5 ml/h 0.9%氯化鈉溶液，D1、D2、D3組分別經(jīng)尾靜脈泵注2.5 μg·kg-1·h-1、5 μg·kg-1·h-1、10 μg·kg-1·h-1DEX(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，持續(xù)2 h。

1.3 方法 造模完成后48 h，采用隨機數(shù)字表法將每組大鼠隨機分為2個亞組(n=5)。

1.3.1 神經(jīng)功能評估及腦含水量：一亞組按參考文獻[5]中應用的改良神經(jīng)功能缺損評分進行神經(jīng)功能評估，評分標準分為肢體運動、感覺、反射及肢體平衡等，評分范圍在0～18分，分數(shù)越高，說明神經(jīng)功能缺損越嚴重。神經(jīng)功能評分完成后，處死該亞組大鼠，取全腦組織，經(jīng)電子天平精確稱重后，放入110℃恒溫干燥箱烘烤24 h至恒重(2次稱重差別<0.2 mg)，用同一電子天平再精確稱干腦組織重量，按照eliot干濕重法計算腦組織含水量，以百分率表示：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.2 基底動脈病理學變化：另一亞組大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，于左心室穿刺置管，快速輸入0.9%氯化鈉溶液200～300 ml進行血液替換，隨即以4%的多聚甲醛固定液進行前固定，待大鼠全身僵硬后，斷頭取腦組織及腦干4%多聚甲醛后固定24 h。常規(guī)脫水石蠟包埋，制備切片。蘇木素染色制備光鏡切片，光鏡下觀察基底動脈病理學變化。

1.3.3 馬組織Bax、BCL-2、TNFA表達：采用免疫組化法染色檢測海馬組織Bax(批號：AF0120，上海聚士隆生物科技有限公司)、BCL-2(批號：AF6139，上海聚士隆生物科技有限公司)、TNFA(批號：AF7014，上海聚士隆生物科技有限公司)表達情況。取腦組織光鏡切片，常規(guī)脫水，枸櫞酸鈉修復抗原，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，以山羊血清工作液封閉，分別加入Bax(1∶100)、Bcl-2(1∶100)、TNF(1∶100)一抗孵育，4℃過夜，二抗(兔抗SP檢測試劑盒，批號：15155A08，中杉金橋生物技術有限公司)常溫孵育1 h，DAB(20×，批號：15155A08，中杉金橋生物技術有限公司)顯色。

2 結果

2.1 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠神經(jīng)行為學評分比較 與C組比較，S組、D1組、D2組和D3組神經(jīng)行為學評分升高(P<0.05)，D2、D3組神經(jīng)行為學評分低于S組(P<0.05)，D1組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠神經(jīng)行為學評分比較 n=5,分,

注：與C組比較，*P<0.05；與S組比較，#P<0.05

2.2 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠腦水含量比較 S組、D1、D2、D3組腦水含量高于對照組(P<0.05)，D3組腦水含量低于S組(P<0.05)，D1組和D2組與S組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組別腦水含量C組 76.7±0.9S組 80.5±0.7*D1組79.9±0.7*D2組79.7±0.7*D3組78.6±0.6*#

注：與C組比較，*P<0.05；與S組比較，#P<0.05

2.3 基底動脈改變 與C組比較，S組、D1組和D2組基底動脈可見明顯的痙攣，D1組痙攣緩解不明顯，D2組痙攣明顯緩解，D3組基底動脈可見微弱的血管痙攣。見圖1。

C組S組D1組D2組D3組

圖1基底動脈改變(光鏡×40)

2.4 海馬組織Bax、BCL-2、TNFA表達比較 S、D1、D2、D3組TNF表達明顯升高，其中D1組與S組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，D2、D3組與S組相比，TNF表達明顯減少(P<0.05)；與S組相比，D1、D2、D3組Bcl-2表達逐漸增高(P<0.05)；與C組相比，S、D1、D2組Bax表達明顯升高，D1組與S組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，D2、D3組表達較S組明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠的海馬組織Bax、BCL-2、TNFA表達比較 n=5,個

注：與C組比較，*P<0.05；與S組比較，#P<0.05

3 討論

有研究表明，DEX有明確的腦保護作用，其在顱腦手術、術中喚醒、術后鎮(zhèn)靜及藥物戒斷治療中得到了一致的認可[6]。大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型在基礎研究中得到了廣泛的應用，其中包括：枕大池注血法、視交叉注血法和血管穿刺法等方法。由于血管穿刺法的出血量不易控制等特點，其中，枕大池注血法能夠人為的控制模型出血情況，且能夠很好的模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血患者病理生理的變化，應用廣泛。本研究采用單次枕大池內(nèi)注入1 mg/kg自體血法制備大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，可以很好的模擬出血后急性期腦組織病理生理改變。參照文獻[7]，本研究選取3個劑量2.5 μg·kg-1·h-1、5 μg·kg-1·h-1和10 μg·kg-1·h-1進行觀察。

神經(jīng)功能缺損程度評分是評價機體神經(jīng)功能是否損傷及損傷程度的客觀評價指標。最常見的神經(jīng)功能評分方法有姿勢反射測試、肢體放置測試及平衡木測試，這些測試分別從肢體運動、感覺、反射、平衡和機體協(xié)調(diào)等方面對大鼠的神經(jīng)功能做出評價。最終評分越高，說明神經(jīng)行為功能損傷越嚴重，反之，越輕。本研究S組大鼠造模成功后，從手術開始到大鼠清醒1.5～2 h。造模后48 h內(nèi)可見大鼠精神萎靡，行動減少，進食水減少，對驚嚇反射及眨眼反射等反應明顯遲鈍。本研究對象雌雄不限，觀察到雌性大鼠術后清醒時間明顯短于雄性大鼠，且術后雌性大鼠精神狀況及飲食情況明顯好于雄性大鼠。由于本研究樣本量有限，性別及雌雄激素是否對蛛網(wǎng)膜下腔出血預后有影響及影響機制，尚需進一步的研究和證明。本研究結果顯示，S組、D1組、D2組和D3組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分明顯高于C組(P<0.05)，D1組與S組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，D2、D3組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分明顯低于S組和D1組(P<0.05)，可見中高劑量DEX可以改善腦出血后神經(jīng)行為學的變化。

腦水腫是指腦內(nèi)外各種因素影響導致腦細胞，組織等含水量增多的一種病理現(xiàn)象，是導致顱內(nèi)高壓的重要因素。目前，針對顱內(nèi)高壓及腦水腫的治療方式主要為輸注甘露醇高滲溶液和去骨瓣減壓術，但該治療措施作用持續(xù)時間短，治療后顱內(nèi)壓反彈現(xiàn)象明顯。有報道，蛛網(wǎng)膜下腔出血可以改變大鼠的神經(jīng)行為，引起腦水腫，增加血腦屏障的通透性。DEX可以激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)改善蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的上述損傷[8]。同時，DEX可以明顯改善腦損傷，腦卒中患者的預后，這與DEX減少炎性因子、氧化自由基的釋放，減輕腦損傷后腦組織的炎性反應及過氧化反應有關。 本研究顯示，高劑量DEX緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期腦水腫的發(fā)生明顯優(yōu)于中低劑量組。臨床工作中，DEX主要用于蛛網(wǎng)膜下腔出血患者鎮(zhèn)靜，大劑量的應用可緩解顱腦損傷所引起的一系列反應，但對循環(huán)及各項生命體征的影響應進一步權衡利弊。DEX減輕腦損傷后腦水腫的發(fā)生，與血腦屏障上α-2腎上腺素受體結合位點無關，DEX的腦保護作用是否與機體非腎上腺素能結合位點有關，具體結合位點及機制需進一步研究。

Ayoglu等[4]研究認為DEX可以緩解腦出血后腦組織的氧化應激反應，同時DEX存在明顯的緩解腦血管痙攣的作用，其中10 μg/kg作用明顯優(yōu)于5 μg/kg。有報道認為 DEX 對蛛網(wǎng)膜下腔出血導致的大腦前額皮質(zhì)損傷具有劑量依賴性的保護作用,其作用可能與DEX 減輕腦血管痙攣有關[9]。有研究證明，含氧血紅蛋白破壞神經(jīng)源性NO，導致NO功能紊亂引起血管痙攣的發(fā)生[9]。腦血管痙攣和內(nèi)皮素、PKC、瞬時受體電位離子通道、Ca離子通道、炎性因子等有明確的關系[9,10]。本研究應用三種不同劑量，持續(xù)泵注2.5 μg·kg-1·h-1、5 μg·kg-1·h-1和10 μg·kg-1·h-1，2 h驗證DEX對腦血管痙攣的保護作用。低劑量DEX對血管痙攣的緩解作用不明顯，中高劑量DEX可明顯緩解腦血管痙攣的發(fā)生。腦血管痙攣與含氧血紅蛋白，Nitric oxide (NO),protein Kinase C(PKC),自由基，炎性因子,Ca離子及脂蛋白有密切的關系。

有研究發(fā)現(xiàn)，單次枕大池注血所致腦出血模型大鼠，在腦出血急性期，凋亡因子caspase-3、Bcl-2的表達發(fā)生明顯的改變；在模型制備成功后caspase-3表達隨時間的增加而增加，24 h后表達明顯，48 h達到高峰。Bcl-2在腦出血后12 h表達明顯，48 h達到高峰，直到第7天一直處于高表達水平[11]，這為本研究提取標本提供了有利的時間依據(jù)。本研究結果顯示，單次枕大池注血所致腦出血后出血急性期，細胞凋亡因子表達發(fā)生了明顯的變化。出血后，誘發(fā)凋亡反應增強的同時，抗凋亡反應也有所增強。DEX可以通過抑制Bax的表達，促進Bcl-2的表達起到抑制細胞凋亡的作用。機體細胞的凋亡是一個大而復雜的機制，本研究只是單純的從Bax、Bcl-2水平闡明腦出血對海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響及DEX對腦組織的保護作用。

TNF是創(chuàng)傷后應激反應最早表達的炎性因子，它的表達和釋放，對血腦屏障的破壞、神經(jīng)元的損傷和腦水腫的形成起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織病灶區(qū)，TNF-mRNA表達明顯增多，這與TNF參與腦損傷后各種生理反應有關[12]。有報道，大鼠腦缺血再灌注之后，海馬區(qū)TNF、IL-1表達明顯增多，TNF、IL-1的表達改變和腦缺血再灌注損傷存在明顯的關系[13]。蛛網(wǎng)膜下腔出血后，海馬區(qū)TNF表達明顯增多，中、高劑量組，TNF表達減少，說明蛛網(wǎng)膜下腔出血后，誘發(fā)一系列炎性反應，中、高劑量DEX可緩解腦組織炎性反應的加劇，從而緩解顱腦組織的進一步損傷。

本研究結果表明，DEX可以改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)行為學改變，緩解出血急性期減輕腦血管痙攣及腦水腫的發(fā)生。同時，DEX可以通過調(diào)節(jié)凋亡抗凋亡蛋白及炎性因子的表達對腦組織產(chǎn)生保護作用。本研究證明DEX對蛛網(wǎng)膜下腔出血預后，有明顯的改善作用，其中中高劑量組作用明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。以往蛛網(wǎng)膜下腔出血導致腦血管痙攣的模型顯示，DEX對腦血管痙攣的緩解作用呈拋物線狀劑量依賴性。本研究從3個不同劑量出發(fā)探討DEX對蛛網(wǎng)膜下腔出血預后影響，DEX的腦保護作用是否呈劑量相關性將進一步研究。

蛛網(wǎng)膜下腔出血已成為臨床上的多發(fā)病之一，嚴重影響著患者的生活及生命安全。蛛網(wǎng)膜下腔出血急性期，血凝塊聚集在蛛網(wǎng)膜下腔，不能及時被吸收，含氧血紅蛋白釋放氧自由基，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，同時釋放血管活性因子導致神經(jīng)細胞及血管壁結構破壞。正常情況下，機體各種調(diào)節(jié)機制及通路處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。腦出血的發(fā)生導致機體平衡失調(diào)，誘發(fā)一系列的保護及過度保護反應。炎性反應和過氧化反應可以導致細胞結構功能破壞，最終引起血腦屏障通透性增加、脈絡叢異常、腦脊液回流障礙、腦血管痙攣。細胞凋亡反應是一種生理性的細胞死亡過程，是組織器官的保護性功能。蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生，導致該功能調(diào)節(jié)異常，正常腦組織，如：海馬、腦皮質(zhì)等部位神經(jīng)細胞過度凋亡，最終引起機體神經(jīng)功能障礙。同時，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度表達、JNK、P38MAPK通路、膽堿能抗炎通路、TRPC通路等都與蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的腦損傷有關。大量研究證明DEX對腦組織有明確的腦保護作用，并且程劑量相關性。DEX可以通過調(diào)節(jié)細胞的凋亡反應、過氧化反應、炎性反應及JNK、P38MAPK、TRPCD、α7nAChR通路等抑制腦組織損傷[14,15]，減輕腦損傷后引起的神經(jīng)功能異常、腦水腫腦血管痙攣等的發(fā)生。但DEX作用的最終機制為抗炎、抗氧化、抑制凋亡反應。本研究從3種不同劑量探討DEX對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能的影響，具體機制、DEX作用位點及DEX的腦保護作用是否呈劑量相關性有待進一步研究。