α-突觸核蛋白的高效表達純化及表征

賈龍剛，王 英，路福平，劉夫鋒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性病[1].世界帕金森病協(xié)會統(tǒng)計資料顯示，目前全球已有500 多萬PD 患者，是繼腦卒中后遺癥、癲癇之后危害神經(jīng)系統(tǒng)的第3 大類疾病.據(jù)報道[2-3]：每年每10 萬人中就有10～18 個人患PD，其中男性與女性患者比例約為3﹕2.隨著年齡增長，發(fā)病率會逐年增加，80 歲以上發(fā)病率和年齡呈指數(shù)增長.預計[4]到2030 年，全球50 歲以上中老年人中，PD 患者將達870～930 萬.

雖然對于PD 的發(fā)病機制和致病機理尚未完全解析，但現(xiàn)有研究[5-6]表明多種因素參與其中，包括細胞自發(fā)性過程如自噬和溶酶體功能障礙等.PD 的主要病理特征是在病人黑質致密部或其他有顏色的核心結構的多巴胺能神經(jīng)元中含有一種嗜酸性細胞質內含物，即路易小體，而α-突觸核蛋白(α-synuclein，α SN)是路易小體的主要成分[7-8].α SN 能夠聚集形成一系列大小和形狀各異的聚集體，這些聚集體會毒害細胞、破壞神經(jīng)信號傳遞，從而與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關[7].因此，α SN 的聚集及其抑制劑開發(fā)就成為近年來的研究熱點.

目前，該蛋白的來源主要有以下兩種：生物表達法和組織提取法.Zhao 等[9]將α SN 基因連接至pET15b 載體中，在大腸桿菌中表達獲得含有標簽的融合蛋白，利用TEV 蛋白酶將融合標簽切除后獲得α SN.然而，切除標簽的過程復雜，后期還需經(jīng)過離子交換、分子篩、Ni 柱親和層析等繁瑣的純化步驟，效率較低.另外，乙酰基修飾的α SN 也在大腸桿菌(Escherichia coli)中成功表達，重組細胞經(jīng)蒸煮和硫酸銨沉淀法得到粗蛋白，再依次經(jīng)過離子交換層析和凝膠過濾層析獲得較純的α SN 蛋白[10].然而，蒸煮過程中可能造成蛋白失活或沉淀，同時多步驟純化會大大降低蛋白的產(chǎn)量.綜上所述，目前α SN 的表達純化方法尚存在步驟繁瑣和產(chǎn)量較低等問題[11].這些均制約著對α SN 聚集特性研究及相關抑制劑的開發(fā).

本研究提供了一種簡便高效的在大腸桿菌中表達純化α SN 的方法，優(yōu)化了表達及純化條件，并通過硫磺素T(ThT)熒光實驗分析了該重組蛋白的聚集特性，利用細胞毒理學實驗研究了α SN 聚集體的細胞毒性.

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室保存的大腸桿菌(Escherichia coli)Jm109 和BL21(DE3)用于本研究中α SN 的表達.

表達載體質粒pET22b，Novagen 公司；Ni-NTA瓊脂糖樹脂，Qiagen 公司；高保真DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶及限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ，寶生物工程(大連)有限公司；質粒小量提取試劑盒，北京索來寶科技有限公司；硫磺素T(ThT)，Sigma 公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，Tocris 公司；其他試劑均為分析純，上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 DNA 片段、引物設計合成及pET-α SN 表達載體的構建

根據(jù)α SN 氨基酸序列，經(jīng)密碼子偏好性優(yōu)化后獲得相應DNA 序列.DNA 片段、PCR 引物和測序由蘇州金唯智公司完成.

將合成的α SN 基因用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物α SN，與具有相同黏性末端的pET22b 載體于16 ℃連接4 h；轉化大腸桿菌Jm109感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取陽性轉化子進行菌落PCR 驗證(NdeⅠ-F：GGAATTCCATATGGATGTG TTTATGAAAGGCCT，XhoⅠ-R：CCGCTCGAGGGC TTCCGGTTCATAATCCT)，并提取質粒進行測序鑒定.

1.3 重組α SN 表達及純化

將上述構建好的重組質粒pET22b-α SN 轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得轉化子BL21-α SN，37 ℃靜置過夜培養(yǎng).挑取單菌落至5 mL LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜.按1%接種量轉接至200 mL 新鮮LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至A600＝0.6～0.8.然后，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG 誘導，誘導溫度為16 ℃或 37 ℃，誘導 時 間分 別 為 16 ～18 h 或 4 h.6 000 r/min 離心10 min 收集菌體.BL21 為對照組，誘導條件：IPTG 濃度0.5 mmol/L，誘導溫度16 ℃，誘導時間18 h.

用裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，1 mmol/L DTT)將上述所得菌體重懸，加入終質量濃度為30μg/mL的溶菌酶和體積分數(shù)為 1%的苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰浴30 min 后超聲破碎(超聲功率250 W，開啟 2.5 s，關閉 3 s，總時間 15 min).4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，收集上清液.將上清液與Ni+樹脂在4 ℃下結合30 min 后加入到親和層析柱中.待流出液完全流出后，用10 倍柱體積含不同濃度咪唑的清洗液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，咪唑濃度分別為 10、20、30、40 mmol/L，1 mmol/L DTT)洗滌樹脂，最后用10 倍柱體積的洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，100 mmol/L 咪唑，1 mmol/L DTT)洗脫，最終獲得目標蛋白溶液.

1.4 SDS-PAGE檢測

取20μL 上述各組分樣品，加入5μL 蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min 后離心，取上清液進行檢測.電泳過程：60 V 保持30 min，調節(jié)電壓至120 V，約1 h 后停止電泳.將凝膠取下，切除濃縮膠部分，將剩余膠塊放入考馬斯亮藍染液中，室溫染色30 min，之后將膠塊置于漂洗液中過夜漂洗.

1.5 Dot blot檢測

取誘導后的BL21 和BL21-α SN 細胞破碎上清液及沉淀，沸水浴10 min 后離心，取2μL 上清液滴定至PVDF 膜上.另外選擇帶有His 標簽的脂肪酶蛋白作為陽性對照，同樣取2μL 上清液滴到PVDF 膜上，待晾干后將PVDF 膜放入5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h.之后用pH 8.0 的TBS-T 緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，體積分數(shù)0.05%吐溫20)清洗4 次.將封閉后的PVDF 膜放入鼠抗His 抗體溶液中，4 ℃過夜孵育.將孵育一抗后的PVDF 膜用TBS-T 緩沖液(pH 8.0)清洗4 次，放入羊抗鼠抗體IgG 中，室溫孵育2～3 h.經(jīng)TBS-T 緩沖液清洗4 次后，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)檢測結果.抗體稀釋倍數(shù)均為 1﹕10 000，一抗用5%脫脂奶粉溶液稀釋，二抗IgG 用TBS-T 緩沖液稀釋.

1.6 MALDI-TOF質譜檢測

將上述SDS-PAGE 蛋白膠中目標蛋白條帶切下，置于1.5 mL EP 管中，送至天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院分析測試中心進行質譜分析.

1.7 硫磺素T熒光檢測

利用ThT 熒光實驗來檢測α SN 聚集特性[12-13]，α SN 采用非原位培養(yǎng)法.取適量上述α SN 凍干粉，用20 mmol/L TBS 緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 5.4，150 mmol/L NaCl)溶解，超聲10 min 后，4 ℃、16 000 r/min 離心20 min，取上層溶液體積的75%.利用Nanodrop 2000(美國Thermo Fisher Scientific 公司)檢測蛋白濃度，并配成終濃度為50μmol/L 的α SN 溶液.將上述溶液在含與不含EGCG 條件下置于37 ℃搖床180 r/min 振蕩培養(yǎng).

ThT 溶液同樣利用TBS 緩沖液配制，終濃度為250μmol/L.在不同時間點分別取10μL 上述培養(yǎng)液，加入90μL ThT 溶液，充分混勻.利用Infinite 200 PRO 多功能酶標儀(奧地利TECAN 公司)檢測各樣品熒光強度，激發(fā)波長為440 nm，發(fā)射波長為485 nm.

1.8 MTT實驗分析重組α SN 的細胞毒性

利用MTT 比色法來檢測α SN 聚集體的細胞毒性.首先用DMEM 培養(yǎng)基(10% FBS，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 IU/mL 青霉素和100μg/mL 的鏈霉素)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12 細胞.然后將細胞接種于96 孔板中(5 000 個/孔)，培養(yǎng)24 h 后，加入已培養(yǎng)5 d 的待測樣品，使得蛋白的終濃度為5μmol/L.細胞中加入相同體積PBS 緩沖液為空白對照組.共培養(yǎng) 48 h 后，加入終質量濃度為0.5 mg/mL 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后取出.離心后丟棄上清液，加入100μL DMSO 溶解細胞，37 ℃孵育10 min 后利用多功能酶標儀檢測上述樣品在570 nm 處的吸光度.

2 結果與討論

2.1 pET22b-α SN 表達載體及重組α SN 工程菌的構建

α SN 含140 個氨基酸，相對分子質量約為1.5×104[14].α SN 的N 端(1—60 位氨基酸)包含一個高度保守肽段KTKEGV，這種重復序列是典型的載脂蛋白結合域[15].C 端(96—140 位氨基酸)序列中富含酸性氨基酸殘基和脯氨酸.中間61—95 位氨基酸序列為非β-淀粉樣蛋白組分區(qū)域(NAC)，該肽段在α SN聚集過程中扮演重要角色[16-17].首先基于大腸桿菌密碼子偏好性，對目標基因進行密碼子優(yōu)化，獲得完整的α SN cDNA 序列.將合成的α SN 基因片段與含有相同黏性末端的表達載體框架pET22b 連接，構建pET22b-α SN 表達載體(圖1(a)).連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌Jm109，轉化子經(jīng)菌落PCR 驗證，結果如圖1(b)所示.圖中結果顯示4 個轉化子的PCR 產(chǎn)物大小與α SN 基因(429 bp)理論值一致.提取質粒進一步測序驗證，結果顯示未發(fā)生突變，證明表達載體構建成功.

圖1 表達載體pET22b-α SN 的構建Fig.1 Construction of expression plasmid pET22b-α SN

將上述驗證正確的表達載體質粒pET22b-α SN轉化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)，獲得重組工程菌，命名為BL21-α SN.

2.2 α SN 蛋白表達及鑒定

上述構建好的BL21-α SN 工程菌利用IPTG 進行誘導表達，收集菌體經(jīng)細胞破碎后，SDS-PAGE 分別檢測細胞破碎上清液和沉淀，結果如圖2(a)所示.目標蛋白主要位于破碎上清液中，沉淀中少量的目標蛋白可能是由于破碎不完全或分離不完全造成的，而空白對照組BL21 野生菌的細胞破碎上清液和沉淀都沒有目的條帶，說明α SN 已成功可溶性表達.圖2(a)中顯示目的條帶大小約為2.0×104，與理論大小(1.5×104)有一定的差距，這主要是由目標蛋白C 端的酸性氨基酸區(qū)域結合SDS 能力較弱所造成的[18].

圖2 α SN 的表達及鑒定Fig.2 Expression and identification of α SN

為驗證目標產(chǎn)物為α SN，將目標蛋白條帶切下，利用MALDI-TOF 質譜鑒定，結果如圖2(b)所示.荷質比為1 295.69 的肽段為α SN46-58(理論相對分子質量為1 295.70)，荷質比為1 478.77 的肽段為α SN81-96(理論相對分子質量為1 478.78)，荷質比為2 157.16的肽段為α SN59-80(理論相對分子質量為2 157.0).目標蛋白實際檢測理論相對分子質量為15 518.8，與理論相對分子質量(15 515.7)基本一致.基于上述結果，可以確定所得目標蛋白為α SN.利用免疫點印跡法進一步驗證，結果如圖2(c)所示，重組α SN 具有較強的His 免疫原性，進一步表明目標蛋白已成功表達.

2.3 α SN 蛋白表達純化條件優(yōu)化

為提高目標蛋白表達量，對誘導溫度和誘導時間分別進行優(yōu)化，結果如圖3(a)所示.當誘導溫度為37 ℃、誘導時間為4 h 時，目標蛋白的產(chǎn)量相對較高.因此，后期誘導條件選擇誘導溫度為37 ℃，誘導時間為4 h.由于利用pET22b 質粒表達的蛋白C 端含有His 標簽，因此利用Ni-NTA 親和層析柱純化目標蛋白.對漂洗液中咪唑濃度進行優(yōu)化，結果如圖3(b)所示，當漂洗液中咪唑濃度為20 mmol/L 時純化效果最好.利用優(yōu)化好的條件，每升菌液可獲得α SN蛋白54.9 mg，純度約為96.4%(利用Image J 軟件分析).

圖3 α SN 蛋白表達及純化條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of the expression and purification of α SN

2.4 α SN 蛋白聚集特性及細胞毒理學分析

ThT 熒光染色技術常用于檢測淀粉樣蛋白的聚集特性和篩選淀粉樣蛋白聚集抑制劑[12-13].本研究同樣利用該技術來分析重組α SN 蛋白的聚集特性，并利用已知的聚集抑制劑EGCG 進一步驗證.ThT熒光實驗結果如圖4(a)所示.從該圖可以看出，α SN的ThT 曲線呈現(xiàn)典型的“S”型淀粉樣蛋白聚集曲線，共分為3 個階段：0～72 h 處于遲緩期，72 h 后進入纖維快速伸長期，96 h 后進入穩(wěn)定平臺期.當不同濃度EGCG 與α SN 共培養(yǎng)時，ThT 熒光信號強度始終較小，說明EGCG 抑制了α SN 聚集，從而導致其ThT 熒光信號的強度降低，與前期研究結果一致[19].

利用MTT 實驗進一步研究了重組α SN 聚集體的細胞毒性.將培養(yǎng)5 d 的α SN 聚集體與PC12 細胞共培養(yǎng)，檢測細胞存活率.如圖4(b)所示，當目標蛋白與PC12 細胞共培養(yǎng)時，細胞存活率為對照組的59.47%，證明α SN 聚集形成的聚集體具有較強的細胞毒性.當?shù)葷舛菶GCG 和α SN 共同處理細胞時，細胞的存活率提高了約11%.上述結果表明EGCG 抑制了α SN 的聚集，并降低了α SN 聚集體的細胞毒性.

綜上所述，該重組α SN 具有良好的聚集性和細胞毒性，因此可應用于篩選聚集抑制劑的研究.

圖4 重組α SN 蛋白的特征描述Fig.4 Characterization of recombinant α SN

3 結 語

本文開發(fā)了一種簡便、高效的α SN 表達純化方法，實現(xiàn)了該蛋白的可溶性表達.經(jīng)優(yōu)化表達及純化條件，提高了α SN 的產(chǎn)量，最終每升菌液可獲得54.9 mg，純度約為96.4%的目標蛋白.ThT 和MTT實驗進一步證明該重組α SN 具有良好的聚集性，且聚集體具有較強的細胞毒性.本研究為探索α SN 的聚集特性及篩選聚集抑制劑提供了性質優(yōu)良的生物材料.