脂肪酸?；o酶A 合成酶對釀酒酵母己酸乙酯合成的影響

何亞輝，馬艷蕊，薛星祥，杜永靜，陳葉福，郭學武，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術工程中心，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

中國白酒與白蘭地、伏特加、威士忌、朗姆酒和金酒并稱世界著名的六大蒸餾名酒[1].根據(jù)風味特征的不同，中國白酒可分為4 種主要香型：清香型、濃香型、醬香型和米香型，其中濃香型白酒占據(jù)了中國白酒市場的70%[2-3].己酸乙酯是濃香型白酒的主要特征風味物質，其含量的多少直接決定了濃香型白酒的風味品質.

傳統(tǒng)濃香型白酒發(fā)酵過程中，己酸乙酯主要是在發(fā)酵后期由窖泥微生物中的己酸菌產生的己酸在大曲中酯化酶的作用下與釀酒酵母產生的乙醇發(fā)生酯化反應生成的[4-5].其中的己酸菌屬于厭氧菌，生活在窖泥內部，因此其產生的己酸要參與生成己酸乙酯的過程就要滲透到窖泥的外層到發(fā)酵醅中去，這會增加糧耗并且延長發(fā)酵周期，同時窖泥還會生成一些不良的風味物質如土臭素等，對濃香型白酒品質產生負面影響[6].

在釀酒酵母(S.cerevisiae)中己酸乙酯可以經醇乙?；D移酶催化己酰輔酶A 與乙醇生成己酸乙酯[7-8]，而此時其前體物質己?；o酶A 的濃度是其生成的一個重要限制因素[9].有研究[10]表明添加外源脂肪酸可以提高乙基酯的產量.釀酒酵母在利用外源脂肪酸的時候主要是通過脂酰輔酶A 合成酶的作用，將外源脂肪酸以?；o酶A 的形式攝入胞內，進而增加了胞內?；o酶A 的濃度，然后再經醇乙?；D移酶作用生成相應的酯.例如，中鏈脂肪酸乙酯(己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯)通過增加前體中鏈脂肪酸(MCFAs)的含量，使得中鏈脂肪酸乙酯含量升高，即在一定范圍內，高濃度的MCFAs 可以促進乙基酯的生成[11].在實際生產中，將培養(yǎng)的己酸菌液加入發(fā)酵曲中作為生產己酸乙酯的前體物質，能夠顯著增加己酸乙酯的產量，并且縮短發(fā)酵周期，降低成本.

釀酒酵母中的脂酰輔酶A 合成酶的基因有FAA1—FAA4、FAT1—FAT2[12-14].Leber 等[15]證明FAA1、FAA2、FAA3 和FAT1 參與外源游離脂肪酸(FFA)的吸收活化用于脂肪酸以及脂肪酸乙酯的合成，F(xiàn)AA2 基因可以將外源脂肪酸直接吸收活化為?；o酶A 的形式并運入過氧化物酶體，降解形成乙酰輔酶A.Asano 等[16]報道，敲除FAA1 基因的清酒酵母可較大幅度地提高己酸乙酯的產量，這是由于FAA1 基因控制絕大部分長鏈脂肪酸的吸收，敲除FAA1 后，長鏈脂肪酸活化為長鏈?；o酶A 的量減少，減輕了對乙酰輔酶A 羧化酶的抑制，使得己酸乙酯的生成量有所提高.Faergeman 等[17]研究表明，釀酒酵母對外源長鏈脂肪酸進行代謝之前，需要先通過?；o酶A 合成酶Faa1p 和Faa4p 吸收和活化，以及Fat1p 轉運蛋白的參與.敲除FAA1 和FAA4 基因后，酵母酰基輔酶A 的水平下降了10%.Knoll 等[18]曾報道過釀酒酵母體內的3 種?；o酶A 合成酶基因 FAA1、FAA2、FAA3，將其編碼的蛋白 Faa1p、Faa2p、Faa3p 分別在缺乏酰基輔酶A 合成酶的大腸桿菌(E.coli)內表達，實驗表明Faa1p 傾向于利用C12∶0—C16∶0 脂肪酸(12～16 個碳的脂肪酸)；Faa2p 利用范圍是C7∶0—C17∶0 脂肪酸；Faa3p 傾向利用C16∶0 和C18∶0 脂肪酸.研究[19]表明，通過同時異源表達產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)的Ⅰ型脂肪酸合成酶系統(tǒng)過表達FAA1，從而提高?；鵆oA 含量，并在此基礎上過表達WS/DGAT基因，脂肪酸乙酯的產量提升了6.3 倍.由此看出，酯酰輔酶A 合成酶對釀酒酵母中己酸乙酯的生成量有一定影響.

本研究構建了脂肪酸酰基輔酶A 合成酶基因FAA1—FAA4、FAT1 的敲除和過表達菌株，并根據(jù)添加己酸發(fā)酵結果構建了FAA3 敲除同時過表達FAA4菌株α5-FAA4ΔFAA3，旨在增強釀酒酵母利用外源己酸生成己酸乙酯的能力.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

本實驗所用的所有菌株和質粒見表1，大腸桿菌(E.coli)DH5α、釀酒酵母(S.cerevisiae)AY15 的單倍體α5 均為天津科技大學天津市工業(yè)微生物重點實驗室保藏.質粒Yep352、pUG6 為本實驗室保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

YEPD 培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10.

LB 培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，氯化鈉10，酵母浸粉5.

以上兩種培養(yǎng)基，自然pH，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂，115 ℃高壓滅菌15 min.

一級種子液：糖度為8 Brix 的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L.

二級種子液：糖度為12 Brix 的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L.

發(fā)酵培養(yǎng)基：60 g 玉米粉按1﹕3(g﹕mL)的料水比加水，70 ℃糊化20 min，加30μL 淀粉酶，85～90 ℃液化90 min，加適量營養(yǎng)鹽和酸性蛋白酶及90μL 糖化酶，55～60 ℃糖化20 min 后待用.

1.1.3 試劑與儀器

淀粉酶(2.9×105U/mL)、糖化酶(1.0×105U/mL)、限制性內切酶、DNA 連接酶、rTaq 聚合酶、RNA 提取試劑盒、質粒精提試劑盒、PCR 純化回收試劑盒及熒光定量PCR 試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；卡那霉素(KanMX)，美國Merck 公司.

所用儀器主要有PCT-200 型PCR 儀、高速離心機、水浴鍋、電子天平、DYY-4c 型電泳儀、照膠儀、移液槍、DL 102x 型電熱鼓風干燥箱、StepOneplusTM實時熒光定量PCR(Real-time PCR)儀、安捷倫7890型氣相色譜、安捷倫1260 型高效液相色譜.

表1 實驗所用質粒和菌株Tab.1 Strains and plasmids used in this study

1.2 實驗方法

本實驗采用酵母基因同源重組基因改造方法，同時結合載體構建技術將相應基因連接到載體Yep352上，然后在釀酒酵母α5 基因組的相應位置上做相關基因的敲除和過表達，并篩選得到重組菌株.

1.2.1 引物

本實驗所用引物均通過Primer 5.0 軟件設計獲得，釀酒酵母基因序列均從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得.引物由金唯智生物科技有限公司合成.

1.2.2 重組質粒Yep-PF1 的構建

將純化后的 FAA1 片段用 Bgl Ⅱ酶切連入Yep352-P，構建表達載體Yep-PF1，構建過程如圖1所示.其余幾個基因的載體構建與此方法相同.

1.2.3 酵母轉化

將準備好的待轉片段使用醋酸鋰轉化法轉化到釀酒酵母α5 中，在含100μg/mL G418 的YEPD 平板上涂布，30 ℃培養(yǎng) 2 d，然后對平板上的單菌落進行篩選驗證.

1.2.4 發(fā)酵驗證

從斜面上挑取1 環(huán)菌種接種到5 mL 一級種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，再按照10%的集中量將一級種子液接種到45 mL 二級種子液中，30 ℃靜置培養(yǎng)16～17 h，再按照10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，每隔12 h 進行CO2失重測定.每個樣品做3個平行樣.

圖1 重組質粒Yep-PF1的構建Fig.1 Construction of plasmid Yep-PF1

1.3 分析方法[20]

1.3.1 發(fā)酵數(shù)據(jù)測定

每隔12 h 對發(fā)酵樣品進行CO2失重測定，采用斐林試劑法測定樣品中殘還原糖的量，酒精計比重法測發(fā)酵完樣品酒精度.

1.3.2 己酸乙酯的測定

發(fā)酵結束后對發(fā)酵液進行蒸餾，對蒸餾樣進行氣質聯(lián)用(GC-MS)分析.將酒樣稀釋到體積分數(shù)12%，取8 mL 樣品于 20 mL 螺口頂空進樣瓶，加入3 g NaCl 后，再放入攪拌子，用封口膜封好.樣品在恒溫磁力攪拌器中60 ℃平衡10 min，將萃取頭插入瓶內頂空吸附40 min.萃取后將萃取頭插入GC-MS 系統(tǒng)進樣器，250 ℃解吸附5 min.GC-MS 檢測條件：色譜柱為HP-5MS(60 m×0.32 mm×0.25μm)石英毛細管柱；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣，流量1 mL/min；起始柱溫40 ℃保持3 min，以9 ℃/min 升至116 ℃，保持4 min，再以9 ℃/min 升至260 ℃，保持5 min；不分流進樣.質譜儀條件：離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓1 280 V，掃描范圍m/z 為40～450.

1.3.3 脂肪酸的測定

脂肪酸的測定首先將其衍生化為易揮發(fā)的甲酯再用GC-MS 進行分析.衍生條件：取30 mL 發(fā)酵上清液，加入6 mL 氯仿-甲醇溶液(體積比為2﹕1)，充分振蕩30 s，4 ℃、5 000 g 離心10 min，氯仿相氮氣吹干后加入0.5 mol/L NaOH-CH3OH 溶液1 mL，65 ℃保溫30 min，室溫冷卻后加入BF3-CH3OH 溶液1 mL，70 ℃保溫2 min 后，冷卻至室溫，加入1 mL正己烷振蕩萃取，同時加入適量飽和NaCl 溶液和無水Na2SO4除水，最后吸取正己烷層過膜后待測[21].GC-MS 檢測條件：色譜柱HP-5MS(60 m×0.32 mm×0.25μm)石英毛細管柱；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，流量1 mL/min；柱溫起始為200 ℃保持0 min，以2 ℃/min 升至230 ℃，保持0 min，再以8 ℃/min 升至260 ℃，保持15 min；分流比1﹕1 進樣.質譜儀條件：離子源為 EI 源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓1 280 V，掃描范圍m/z 為40～450.

1.3.4 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

對重組菌株相應基因的表達水平采用實時熒光定量 PCR 測定.重組菌株用 YPD 液體 30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，用酵母RNA 試劑盒提取mRNA，以mRNA 為模板，采用反轉錄試劑盒合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，以cDNA 為模板，對FAA4基因進行實時熒光定量PCR.實時熒光定量PCR 反應條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 個循環(huán).以肌動蛋白基因ACT1 為內參基因.

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個樣品做3 個平行樣，應用SPSS 11.0 和Origin 8.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析.

2 結果與討論

2.1 出發(fā)菌的耐己酸實驗

由于高濃度的脂肪酸會對釀酒酵母的生長產生抑制，在不影響酵母生長的條件下，為確定合適的己酸添加濃度，進行了出發(fā)菌α5 耐己酸實驗.選定在YEPD 平板中添加不同濃度的己酸，將30 ℃過夜搖床培養(yǎng)的酵母菌稀釋一定倍數(shù)涂布于平板上，觀察長勢，己酸添加量分別為0%、0.005%、0.01%、0.02%，結果如圖2 所示.選定體積比0.01%作為己酸添加濃度.

2.2 脂肪酸?；o酶A合成酶基因的敲除對己酸乙酯產量的影響

本實驗通過用loxP-KanMX-loxP 片段替代了對應的?；o酶A 合成酶基因，得到對應的敲除菌株α5ΔFAA1-4 和α5ΔFAT1；通過把對應的過表達盒敲入到對應的酰基輔酶A 合成酶基因位點，得到對應的過表達菌株.以下以敲除FAA2 為例闡述重組菌株的構建過程.以釀酒酵母α5 基因組為模板，PCR 擴增得到FAA2 基因的上、下游同源臂片段FA(482 bp)、FB(512 bp).以pUG6 質粒為模板，PCR 擴增得到KanMX 片段(1 613 bp).其電泳結果如圖3 所示，PCR 擴增的特異性條帶大小與目標片段大小一致，結果正確，擴增產物經PCR 純化回收或切膠回收.

在含有1 000 mg/L G418 抗性的YEPD 平板上篩選重組突變菌.在30 ℃培養(yǎng)的抗性板上挑取轉化子進行PCR 驗證.以出發(fā)菌株α5 的基因組為陰性對照，F(xiàn)AA2 基因缺失菌株基因組為模板，分別對突變菌的上、下游進行PCR 定點驗證，結果如圖4 所示.由圖4 可見：得到784 bp 和1 587 bp 大小的特異性條帶，與預期大小一致.陰性對照無條帶，說明FAA2 敲除菌株α5ΔFAA2 構建成功.

基因敲除后自身會導致中短鏈脂肪酸乙酯產量變化，為排除其對后續(xù)添加己酸發(fā)酵實驗的干擾，進行了敲除菌株玉米濃醪液態(tài)發(fā)酵實驗作為空白對照，結果如圖5 所示.突變株相較于出發(fā)菌株的脂肪酸乙酯產量變化都很小(小于0.5 mg/L).

圖4 突變株α 5ΔFAA2 PCR 定點驗證Fig.4 PCR verification of the mutant strain α 5ΔFAA2

圖5 突變株在不添加己酸時的脂肪酸乙酯產量Fig.5 Comparison of fatty acid ethyl esterse production without adding caproic acid of mutant strains

添加己酸經玉米醪發(fā)酵后檢測的中鏈脂肪酸乙酯(FAEEs)和游離脂肪酸(FFAs)產量結果如圖 6所示.

從圖6 中可以看出：FAA3 基因敲除菌α5ΔFAA3在添加己酸發(fā)酵后，己酸乙酯產量相較于出發(fā)菌α5提高了23.8%，產量提高了約2.6 mg/L.辛酸乙酯和癸酸乙酯產量也分別提高了50.0%和25.5%.推測FAA3 基因能夠將己酸活化為己酰輔酶A 并送入過氧化物酶體中進行降解，因為在有些可以利用脂肪酸作為碳源的菌中，F(xiàn)aa3p 傾向于將C16∶0 和C18∶0的脂肪酸經過幾次的β 氧化最終變成乙酰CoA 進入TCA 循環(huán)，因此這個過程也會對己酰CoA 產生一定的降解作用，則敲除FAA3 基因有助于提高己酰輔酶A 的積累.游離的飽和脂肪酸會顯著影響白酒的品質，突變株中長鏈脂肪酸C16∶0 的產量提高了67.5%.這也說明酵母確實有攝入外源脂肪酸的能力，證明了實驗的可行性.

圖6 出發(fā)菌和突變株在添加己酸后的中鏈脂肪酸乙酯和游離脂肪酸的產量Fig.6 FAEEs and FFAs yield after adding caproic acid of α5 strain and mutant strains

2.3 脂肪酸?；o酶A 合成酶基因的過表達對己酸乙酯產量的影響

為了進一步研究各基因對己酸攝入的作用，分別構建了?；o酶A 合成酶基因用PGK1 強啟動子在原位點過表達菌株α5-FAA1—α5-FAA4、α5-FAT1 和以OPI1 為敲除整合位點的過表達菌株α5O-FAA1—α5O-FAA4、α5O-FAT1(其中OPI1 是肌醇負調控基因，敲除OPI1 能夠提升風味酯的產量，所以選擇此位點).玉米濃醪液態(tài)發(fā)酵空白對照實驗結果如圖7所示.

從圖7(a)中可知：與出發(fā)菌α5 相比，突變菌α5-FAA1—α5-FAA4、α5-FAT1 己酸乙酯等中鏈脂肪酸乙酯的產量都有一定量的浮動，但變化量很小，可忽略不計.由圖7(b)可知：α5O-FAA1 菌株己酸乙酯有一定量的提高，但變化量在1.0 mg/L 以下，變化量較小.

圖7 出發(fā)菌和單過表達菌在不添加己酸時的脂肪酸乙酯產量Fig.7 Fatty acid ethyl esters yield without adding caproic acid of α5 strain and single overexpressing strains

經添加己酸發(fā)酵后，己酸乙酯結果如圖8 所示，相較于出發(fā)菌α5，F(xiàn)AA4 過表達菌株α5-FAA4 中己酸乙酯產量提高了32.1%，增加了約3.5 mg/L，辛酸乙酯和癸酸乙酯產量也分別提高了61.5%和47.9%.α5O-FAA4 中己酸乙酯產量提高了20.7%，辛酸乙酯也提高了12.7%.結果表明FAA4 基因過表達能夠較大幅度地提高對己酸的攝入，增加前體己酰輔酶A的含量.

游離脂肪酸結果如圖9 所示，α5-FAA4 的長鏈脂肪酸C16∶0 和C18∶0 的產量分別增加了174%和77%；α5O-FAA4 的長鏈脂肪酸C16∶0 和C18∶0 的產量分別增加了125%和86%.

圖8 出發(fā)菌和單過表達菌在添加己酸后的脂肪酸乙酯產量Fig.8 Fatty acid ethyl esters yield after adding caproic acid of α5 strain and single overexpressing strains

圖9 出發(fā)菌和單過表達菌在添加己酸后的游離脂肪酸產量Fig.9 FFAs production after adding caproic acid of α5 strain and single overexpressing strains

2.4 敲除FAA3 同時過表達FAA4 對己酸乙酯產量的影響

為了進一步提高己酸攝入，增加己酸乙酯生成量，構建了用PGK1 強啟動子過表達FAA4 同時敲除FAA3 的重組菌株α5-FAA4ΔFAA3.玉米濃醪液態(tài)發(fā)酵空白對照實驗結果如圖10 所示.相較于出發(fā)菌α5，重組菌α5-FAA4ΔFAA3 中己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯都有一定量的提升，但變化量都很小.

圖10 出發(fā)菌和重組菌在不添加己酸時的脂肪酸乙酯產量Fig.10 Fatty acid ethyl esters production without adding caproic acid of α5 strain and recombinant strains

經添加己酸發(fā)酵后，中鏈脂肪酸乙酯和游離脂肪酸結果如圖11 所示.

圖11 出發(fā)菌和重組菌在添加己酸后的脂肪酸乙酯和游離脂肪酸產量Fig.11 Fatty acid ethyl esters and FFAs production after adding caproic acid of α5 strain and recombinant strains

重組菌中己酸乙酯產量達到了17.34 mg/L，相比于出發(fā)菌α 5 提高了57.4%，辛酸乙酯和癸酸乙酯也分別提高了106%和48%.其長鏈脂肪酸C16∶0 和C18∶0 的產量分別提高了219%和119%.結果表明，敲除FAA3 和過表達FAA4 能夠顯著提高己酸攝入，增加己酸乙酯的生成量.

基于上述結果，測定了出發(fā)菌α5 與重組菌α5-FAA4、α5O-FAA4、α5-FAA4ΔFAA3 中FAA4 基因的表達水平，并與其己酸乙酯產量作對比，結果見表2.

重組菌株α5O-FAA4、α5-FAA4 和α5-FAA4ΔFAA3 的FAA4 基因表達量分別是出發(fā)菌株α5 的3.6、9.1 和10.7 倍；且隨著FAA4 基因表達量的提高，己酸乙酯產量也有相應的提高.這證明FAA4 基因過表達能夠提高己酸的攝入，增加己酸乙酯生成量.

表2 出發(fā)菌和重組菌中的FAA4 基因表達水平和己酸乙酯產量Tab.2 FAA4 gene expression level and ethyl caproate production of α5 strain and recombinant strains

2.5 重組菌株的發(fā)酵性能

進一步測定工程菌α5-FAA4ΔFAA3 在玉米水解液中的生長和發(fā)酵性能(生物量、CO2失重、殘?zhí)恰⒕凭?，與α5 比較，評價其生長發(fā)酵性能.如圖12所示.

圖12 出發(fā)菌和重組菌的生長發(fā)酵特性Fig.12 Growth fermentation characteristics of α5 strain and recombinant strain

α5-FAA4ΔFAA3 與出發(fā)菌α5 相比，生長速率相近，在14 h 達到了穩(wěn)定期，α5-FAA4ΔFAA3 最終生物量略有升高.重組菌發(fā)酵速率也有所提高，最終CO2失重量一致.殘?zhí)呛途凭葻o顯著差異(表3).綜上所述，重組菌的生長速率、生物量、酒精度及CO2失重方面的發(fā)酵性能相對于出發(fā)菌株來說略有提升.

表3 出發(fā)菌和重組菌發(fā)酵后的酒精度和殘?zhí)荰ab.3 Alcohol content and residual sugar after fermentation of α 5 strain and recombinant strain

3 結 語

提高己酸乙酯的含量是中國濃香型白酒的主要研究方向之一，其中主要有兩個途徑：一是提升白酒酵母的產酯能力，二是在釀造工藝通過添加外源己酸來增加己酸乙酯的含量.本研究是通過將兩種方式結合，構建了重組菌α5-FAA4ΔFAA3，提高了白酒酵母對外源己酸的攝入能力，進而增加了己酸乙酯合成所需己酰輔酶A 的量，從而促進了己酸乙酯的生成.其中敲除菌株中單敲FAA3 菌株己酸乙酯提高較明顯，過表達菌株中單過表達FAA4 菌株己酸乙酯提高較明顯，進而構建了過表達FAA4 同時敲除FAA3的重組菌α5-FAA4ΔFAA3，其己酸乙酯生成量達到了17.34 mg/L，相較于原菌α5 提高了57.4%.能夠顯著提高釀酒酵母在酒精發(fā)酵階段利用外源己酸生成己酸乙酯的能力.