IL35+B細胞在系統性紅斑狼瘡患者外周血中表達分析

陸玲娜 韓文倫

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫性疾病，與免疫耐受機制的逐漸惡化有關。目前主要認為B 淋巴細胞多克隆活化與T、B 淋巴細胞凋亡紊亂與系統性紅斑狼瘡的發病機制有關［1］。研究認為B 細胞通過分泌IL10 參與免疫抑制，并與自身免疫性疾病具有相關性［2］。B 細胞還可以通過分泌IL-35 發揮免疫調節功能［3-4］。IL-35（p35/Ebi3）屬于IL-12 家族成員，其特征在于由α 鏈（p35）和β 鏈（Ebi3）相互作用形成的異二聚體，被認為主要由調節性T 細胞分泌，并在體外和體內疾病模型被證明具有抑制T 細胞增殖的功能［5］。近年來有研究發現B 細胞也能夠分泌IL35，同樣具有負性免疫調節作用，且與在動物模型實驗中證明B 細胞分泌的IL35 與自身免疫性疾病具有相關性［4］。本文探討SLE 活動期與靜止期CD19+EBI3+p35+B細胞（IL35+B 細胞）的表達變化及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017 年8 月至2018 年8 月本院系統性紅斑狼瘡患者41 例，男6 例，女35 例；年齡15～69 歲，平均年齡36.3 歲。均符合1997 美國風濕病學學會制定的診斷標準。SLE 疾病活動性通過疾病活動指數（SLEDAI）判斷，其中初發、未治療的活動期SLE 患者16 例（SLEDAI＞9），穩定期患者21 例（SLEDAI ≤9）口服潑尼松5～6g/d 維持治療。本院同期體檢健康者17 例為對照組，男1 例，女16 例；年齡20～75 歲，平均年齡38.4 歲。所有研究對象均采集EDTA 抗凝外周血標本2ml。所有樣本均將巨細胞病毒、單純皰疹病毒、風疹病毒、弓形蟲、輪狀病毒、柯薩奇病毒、支原體、衣原體、甲型肝炎B、C、D 病毒感染及其他自身免疫性疾病和慢性感染性疾病排除在外。本項目經本院倫理評審委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意。

1.2 方法 （1）PBMC 制備與刺激：采用密度梯度離心法從EDTA 抗凝全血中分離出PBMC，將分離的PBMC 懸浮在添加10%胎牛血清、2mmol/L 谷氨酰胺和100U/ml 青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養基（均購于GIBCO 公司）中，加細胞刺激混合劑（BD 公 司，Cat：550583，）， 內 含50ng/ml PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）、1μg/ml 離子霉素和10μg/ml brefeldin A。37℃，5%CO2的培養箱中培養4h。（2）IL35+B 細胞測定：培養后PBMC 加FITC-CD19（Beckman coulter，Cat：A07768）胞外染色15min，使用Cytofix/Cytoperm kit（BD Biosciences，Cat：554714） 固 定破 膜， 加 入PerCP-IL12/IL-35 p35（Cat：IC2191C，R&D Systems），PE-IL12/IL35 EBI3（Cat：360904，Biolegend）胞內染色15min，上機檢測。用未刺激的外周血單個核細胞作為同種型對照被用來確認染色的特異性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 統計學軟件。計量資料以（±s）表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，兩組間比較采用Mann Whitney U 檢驗，相關性檢驗采用spearman 秩相關。P＜0.01 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 系統性紅斑狼瘡活動期IL35+B 細胞表達 檢測三組IL35+Breg表達頻率，活動期SLE為（1.063±1.467）%，穩 定 期SLE 為（3.458±3.124）%， 健 康 對 照 組為（4.639±3.047）%。三組比較差異有統計學意義（P=0.0002），活動期SLE 患者IL35+B 細胞表達低于穩定期SLE 與健康對照組（P=0.0019），穩定期SLE 與健康對照組比較差異無統計學意義（見圖1）。

圖1 三組IL35+B細胞表達比較

2.2 IL35+B 細胞表達與SLEDAI 評分及其他實驗室指標的相關性 SLE 患者IL35+B 細胞的表達與SLEDAI評分呈負相關（r=-0.4663，P=0.0036），而與補體C3、C4 水 平 呈 正 相 關（r=0.5878，P=0.0001；r=0.6242，P＜0.0001）。與IgG、IgA、IgM 未見相關性。見圖2。

圖2 spearman秩相關分析

3 討論

IL-35 是IL-12 家族的異源二聚體細胞因子的成員。由p35 和Ebi3 兩個亞基的組合形成［6］。IL-35 開始被發現僅由T 調節細胞（Treg）產生［7］。但隨著研究的深入，發現IL-35 還可以由耐受性樹突狀細胞［8］和B 細胞產生［9-10］。研究表明，IL-35 在免疫應答中起重要的負性免疫調節作用，IL-35 表達降低與多種炎癥狀態有關，如炎癥性腸病、肝纖維化、心肌炎、腦脊髓炎和自身免疫性疾病，且與疾病的嚴重程度有相關性［11］。傳統認為B 細胞是SLE 發病的中心環節，這可能與B 細胞是固有免疫與適應性免疫之間的重要連接有關，一方面B 細胞作為抗原提呈細胞誘導特異性免疫，另一方面作為體液免疫的效應細胞應答抗原。B 細胞也可以通過Toll 樣受體（TLR）的表達和一系列細胞因子的產生對自身或者外來抗原作出反應，而這些細胞因子可以放大或下調免疫應答［12］。但由B 細胞分泌的IL35 在SLE 中的作用尚不明確。

本研究顯示，SLE 活動期組IL35+B 細胞表達明顯低于穩定期組與健康對照組，而穩定期組與健康對照組差異無統計學意義。且SLE 患者IL35+B 細胞的表達與SLEDAI 評分呈負相關。SLEDAI 是臨床上常用于評價SLE 活動度的綜合評分系統，評分＞9 分為SLE 進入活動期，并隨著病情加重而評分上升。研究結果提示隨著SLE 活動增強，IL35B+細胞表達下調。提示IL35+B 細胞可能參與SLE 活動期的發生發展。隨著B細胞分泌的IL35 水平明顯降低，機體內免疫抑制調節功能減弱，促炎反應增強導致細胞因子網絡的失衡而誘發SLE［13］。而SLE 治療有效時可以上調IL35+B 細胞的表達，并能達到健康水平。表明隨著SLE 癥狀的緩解與穩定，機體內抑炎作用增強，促炎作用下調，并重新回到平衡狀態。

本資料結果顯示，SLE 患者IL35+B 細胞的表達與補體C3、C4 水平呈正相關。經典補體系統參與SLE的發病機制已經建立。SLE 時，由自身抗體和免疫復合物激活的經典補體系統可引起炎癥和組織損傷，同時補體C3、C4 被消耗［14］。但作為SLE 生物標志物的C3 和C4 有幾個缺點。特別是正常血漿中的C3 和C4的范圍較寬，與正常血漿中的C3 和C4 重疊。此外，補體激活過程中消耗的C3 和C4 會導致合成增加，導致蛋白質水平無變化。總的C3 和C4 水平不一定反映整個補體系統激活，雖然可溶性補體分裂產物（如C3a 和C4a）的增加可能在生理上更與補體激活有關，但其在血漿中穩定性差，難以檢測。因此目前尚無取代C3 和C4 作為SLE 的生物標志物。IL35+B 細胞的表達是否能作為新的指標有待后期進行大樣本的研究。

綜上所述，活動期SLE 患者IL35+B 細胞的表達頻率明顯降低，且與SLEDAI 評分呈負相關，與補體C3、C4 呈正相關。提示IL35+B 細胞在SLE 發病機制中可能具有重要作用，可能成為新的生物學指標。IL35+B 細胞對SLE 的具體調節機制有待進一步研究。