基于RNA干擾技術(shù)分析MCM7在涎腺腺樣囊性癌中的作用

帥旌 宋藝蔚 朱欣 顧天憶 溫慶良

涎腺腺樣囊性癌（salivary gland adenoid cystic carcinoma，SACC）是常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤之一［1］。其易侵犯神經(jīng)，可隨血液播散，早期浸潤(rùn)性強(qiáng)。臨床上表現(xiàn)為容易復(fù)發(fā)，易向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見(jiàn)是血行轉(zhuǎn)移，晚期轉(zhuǎn)移至肺、骨骼和肝臟，其中肺轉(zhuǎn)移率達(dá)40%［2］。然而目前SACC 轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制的相關(guān)研究依舊匱乏，但有研究發(fā)現(xiàn)SACC 的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移與多種通路及分子有關(guān)［3-5］。微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenanc，MCM）參與DNA 復(fù)制過(guò)程。MCM7 在G1期和S 期對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，使其與細(xì)胞異常增殖及腫瘤形成等關(guān)系密切［6］。較多實(shí)驗(yàn)表明，MCM 蛋白的高表達(dá)是腫瘤發(fā)生的早期事件。2019 年6 月至10月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討MCM7 在涎腺腺樣囊性癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 原位涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-83 及涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-LM 由北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科研究室提供。胎牛血清購(gòu)于四季青公司，SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)于Solarbio 公司，CCK8 細(xì)胞增殖和毒性試劑盒購(gòu)于Beyotime 公司，Transwell 購(gòu)于Corning 公司，Matrigel購(gòu) 于BD 公 司，MCM7 Antibody、GAPDH Antibody 購(gòu)自Proteintech 公司，HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗購(gòu)自碧云天公司。siRNA 定制于百奧邁科生物技術(shù)有限公司，三種序列的siRNA-MCM7 分別為，序列1（正義鏈：5'-GGAUUGUGAAGAUGAACAAdTdT-3'；反義鏈：5'-UUGUUCAUCUUCACAAUCCdTdT-3'），序列2（正義鏈：5'-GGAGAUGAAGAUGCAAGAAdTdT-3'；反義鏈：5'-UUCUUGCAUC-UUCAUCUCCdTdT-3'）， 序 列3（正義鏈：5'-GCAUUGAUGAGUUCGACAAdTdT-3'；反義鏈：5'-UUGUCGAACUCAUCAAUGCdTdT-3'）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SACC-83、SACC-LM 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液1 次/d，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到90%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blot 檢 測(cè)SACC-83、SACC-LM 中MCM7蛋白表達(dá) 在PBL 溶液浸潤(rùn)中刮取培養(yǎng)瓶中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SACC-83、SACC-LM 細(xì)胞，離心，去上清液，添加細(xì)胞裂解液，輕敲EP 管混合后迅速置于冰中，混合1 次/10min，共5 次。4℃，離心，保留上清液，采用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度矯正，加入loading buffer，煮沸。采用SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒配膠，上樣，觀察溴酚藍(lán)至凝膠最下緣終止電泳。轉(zhuǎn)膜2h，封閉1h，TBST 洗滌3 次，一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3 次，稀釋二抗室溫結(jié)合2h，再于TBST 中洗滌3 次。采用ECL 發(fā)光液對(duì)SACC-83、SACC-LM 中MCM7 和內(nèi)參GAPDH 條帶進(jìn)行曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將SACC-LM 細(xì)胞按照50%密度接種至6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度至80%后，將細(xì)胞分為干擾組3 組、陰性對(duì)照組，每組3 孔。在干擾組中分別轉(zhuǎn)染三個(gè)序列的siRNA-MCM7，在對(duì)照組中轉(zhuǎn)染siRNA-Negative Control。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h 后換液，培養(yǎng)48h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組中MCM7 蛋白表達(dá) 選擇轉(zhuǎn)染效率較高的2 組干擾組（si-MCM7-1、si-MCM7-2）與對(duì)照組（NC）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。步驟同1.3。

1.6 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SACC-LM 細(xì)胞，以每孔1000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，接種時(shí)多次吹打，接種后輕微晃動(dòng)以均勻分散細(xì)胞。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96h 后對(duì)3組細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞增殖情況 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期SACC-LM 細(xì)胞，以每孔3000 個(gè)細(xì)胞配置100μl 懸液，接種于96 孔板中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將干擾1、2 組、NC 組各設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，于0、24、48、72h 分別將10μl CCK8 溶液在避光環(huán)境下加入各孔，用錫紙包裹繼續(xù)培養(yǎng)3h。以NC 組為對(duì)照組，酶標(biāo)儀測(cè)量490nm 處OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用無(wú)血清的培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋，每孔20μl 基質(zhì)膠固定，置于37℃恒溫箱中放置40min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SACC-LM 細(xì)胞，用不含血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)至8×104個(gè)/ml，上室加入細(xì)胞懸液200μl，下室加入500μl 含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液。置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h 后多聚甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色，PBS 潤(rùn)洗多次，晾干后于倒置顯微鏡下觀察，選取合適平均視野拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SACC-LM 細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)至1×106/ml，接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度至80%后，用20μl 槍頭尖劃平行的直線，PBS 洗3 次，用無(wú)血清培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取相同位置分別于0、24、48、72h 拍攝。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。呈正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SACC-83、SACC-LM 細(xì)胞中MCM7 表達(dá) 惡性程度較低的SACC-83 中MCM7 表達(dá)水平低于惡性程度較高的SACC-LM。見(jiàn)圖1。

2.2 驗(yàn)證siRNA 轉(zhuǎn)染效率 3 組干擾組SACC-LM 細(xì)胞中MCM7 蛋白表達(dá)水平低于NC 組，選取si-MCM7序列1、3 組進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，分別命名為si-MCM7-1 組和si-MCM7-2 組。見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第96小時(shí)，干擾1、2 組SACC-LM 細(xì)胞集落形成密度小于NC 組（P＜0.05）。CCK-8 結(jié)果顯示，干擾1、2 組SACC-LM 細(xì)胞在第24、48、72h 的細(xì)胞存活率低于NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 細(xì)胞侵襲能力 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾1、2 組SACC-LM 細(xì)胞侵襲數(shù)目低于NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾1、2 組SACC-LM 細(xì)胞遷移能力低于NC 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖1 MCM7蛋白在SACC-83和SACC-LM中的表達(dá)

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后MCM7蛋白在SACC-LM中的表達(dá)

圖3 MCM7干擾對(duì)細(xì)胞克隆（A、B）和細(xì)胞增殖（C）的影響

圖4 MCM7干擾對(duì)細(xì)胞侵襲（D、E）的影響

圖5 MCM7干擾對(duì)細(xì)胞遷移的影響

3 討論

RNA 干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）是研究生物基因功能的重要工具，siRNA 是RNAi 的起始誘導(dǎo)物，參與形成沉默復(fù)合體，結(jié)合mRNA 切割使其斷裂、降解，抑制靶基因表達(dá)［7］。本實(shí)驗(yàn)定制與MCM7具有同源性序列的雙鏈RNA，轉(zhuǎn)染，引起MCM7 基因沉默，研究其相關(guān)生物學(xué)功能，驗(yàn)證其作為癌基因促進(jìn)SACC 進(jìn)展的可能性。

MCM 蛋白在細(xì)胞中常以MCM2～7 六聚體發(fā)揮生物學(xué)功能，其為DNA 的復(fù)制許可復(fù)合物，在G1 期和S 期對(duì)細(xì)胞周期具有調(diào)控作用，與細(xì)胞增殖及腫瘤形成等關(guān)系密切［6］。MCM7 是MCM 核心三聚體之一，在MCM 蛋白作用過(guò)程中起重要作用［8］。

近年來(lái)，增殖標(biāo)志物在腫瘤評(píng)估中發(fā)揮重要作用［9-12］。MCM7 是多種惡性腫瘤的重要增殖標(biāo)志物［9-11］。Choy 等［11］報(bào)道食管鱗狀細(xì)胞癌的病變程度增加，MCM7 蛋白表達(dá)程度增加，表明MCM7 表達(dá)與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，因此在評(píng)估食管病變中MCM7 可能作為一個(gè)敏感的增殖標(biāo)志物發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究發(fā)現(xiàn)MCM7 的表達(dá)可輔助診斷部分頭頸部惡性腫瘤，并且可以預(yù)測(cè)疾病預(yù)后。MCM7 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于其在甲狀腺腺瘤與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的陽(yáng)性表達(dá)率［13］。鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌中MCM7的表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度的下降而升高［14］。Wen等［15］研究發(fā)現(xiàn)，T 分期晚期、鄰近組織侵襲、神經(jīng)侵襲和預(yù)后不良的SACC 患者病變組織中有更高M(jìn)CM7表達(dá)可能。生存分析顯示，MCM7 水平較高的患者術(shù)后無(wú)病生存期（Disease Free Survival，DFS）較短，預(yù)后較差。表明MCM7 可能通過(guò)調(diào)節(jié)異常細(xì)胞增殖來(lái)驅(qū)動(dòng)惡性演進(jìn)，從而預(yù)后不良。且在SACC 中，MCM7是比MCM3 更可靠的增殖標(biāo)志。Wen 等［15］研究在組織學(xué)證明MCM7 可能作為癌基因促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌的進(jìn)展，但在細(xì)胞學(xué)層面尚未驗(yàn)證。

SACC-LM 是涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，MCM7 在SACC-LM 中的表達(dá)高于SACC-83，提示MCM7 的表達(dá)可能與腫瘤惡性程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，干擾組（si-MCM7-1 組、si-MCM7-2 組）與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖能力、侵襲能力及遷移能力均降低（P＜0.05），于細(xì)胞學(xué)層面證明MCM7 可能通過(guò)調(diào)節(jié)異常細(xì)胞增殖來(lái)驅(qū)動(dòng)惡性演進(jìn)，與組織層面實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［15］。這可能是由于在DNA 復(fù)制中，MCM7 對(duì)于MCM2-7 解旋酶中的ATP 酶活性起到關(guān)鍵性的作用，抑制其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤侵襲、遷移的特征。已有研究顯示MCM7 可能通過(guò)MCM7-MAPK-細(xì)胞周期蛋白D1 依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)癌癥進(jìn)展［16］有關(guān)通路。MCM7 有望成為SACC的治療靶點(diǎn)，通過(guò)下調(diào)MCM7 蛋白，或能改善SACC的預(yù)后。