蒲枳素發(fā)酵前后有效成分的檢測(cè)

李想 ，談春季 ，李桂霞， 田會(huì)彥 ，鄧云貴 ，魏國(guó)浩 ，王琦 ，劉東海 ，田宗旺

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院；2.石家莊飛龍飼料有限公司)

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中， 多種抗生素被禁用和限用， 研究和開(kāi)發(fā)新的飼料添加劑替代抗生素已成為當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)亟須解決的問(wèn)題。 中藥具有天然性、 多功能性和毒副作用小等特點(diǎn)， 現(xiàn)在已被應(yīng)用到各類(lèi)動(dòng)物的養(yǎng)殖中。 發(fā)酵中藥是借助微生物的作用， 在一定的環(huán)境下對(duì)藥物進(jìn)行發(fā)酵，改變其原有的特性，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的藥效，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。 本試驗(yàn)對(duì)中藥蒲枳素進(jìn)行發(fā)酵， 并測(cè)定發(fā)酵前后有效成分， 以期為中藥發(fā)酵效果檢測(cè)提供資料。 蒲枳素樣品是由石家莊飛龍飼料有限公司組方，混菌固體發(fā)酵前、后提供，主要成分是蒲公英、枳實(shí)、大青葉、山楂等中藥材。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀：島津公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平：瑞士梅特勒公司；超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司； 調(diào)溫電熱套：北京市永光醫(yī)療儀器廠；蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋： 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠； 高速粉碎機(jī)： 飛利浦HR2836型。

1.2 樣品提取

取發(fā)酵前、 后蒲枳素烘干，粉碎。 5.0 克粉碎樣品，加入70%甲醇水至25.0 毫升， 4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，取上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 毫升， 以40 毫升水飽和正丁醇震蕩萃取，連續(xù)萃取4 次，將每次萃取的正丁醇液混合， 再使用40 毫升氨液充分洗滌， 洗滌2 次，棄去氨液， 蒸發(fā)皿蒸干合并的正丁醇溶液液， 加5 毫升超純水溶解殘?jiān)?所得溶液通過(guò)內(nèi)徑1.5 厘米，柱高12 厘米的D101 型大孔吸附樹(shù)脂柱，用50 毫升純水洗脫，水液棄除，使用30 毫升濃度40%的乙醇溶液洗脫，棄去洗脫液，改用80 毫升濃度70%乙醇溶液繼續(xù)洗脫， 留取洗脫液，蒸發(fā)皿蒸干后，殘?jiān)眉状既芙猓⒂?0 毫升容量瓶定容備用。

1.3 樣品凈化

先將免疫親和柱連接于親流操作架的10 毫升注射器下，準(zhǔn)確移取10 毫升樣品提取液注入注射器，調(diào)節(jié)壓力使提取液緩慢通過(guò)免疫親和柱，待提取液完全通過(guò)后，用10 毫升PBS 溶液(pH7.0)淋洗柱子2 次，抽干，棄去全部流出液，再用2 毫升甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑? 毫升流動(dòng)相復(fù)溶， 過(guò)化0.22 微米濾膜，備用。

1.4 檢測(cè)

檢測(cè)條件：高效液相色譜儀(島津，LC-20A，日本)；色譜柱：Ci8(4.6×150 毫米，5 微米)； 流動(dòng)相：A 相為52%的水，B 相為48%的甲醇；流速：1.0 毫升/分鐘；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 微升；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)為360納米，發(fā)射波長(zhǎng)為440 納米。

1.5 蒲枳素中綠原酸的測(cè)定

樣品中綠原酸提取：稱取發(fā)酵前、后蒲枳素各50 克加入水中，煮沸30 分鐘，并不斷加水補(bǔ)充，并定容，測(cè)體積，取蒲公英的提取液，醇沉后，取10 毫升液體，在35℃的水浴鍋中加入1 毫升的FeC13溶液，震蕩搖勻后，靜置60 分鐘，備用。

標(biāo)準(zhǔn)綠原酸配制： 用乙睛將綠原酸對(duì)照品分別稀釋成濃度為0.25 微克毫升，備用。

檢測(cè)： 于200～700 納米波長(zhǎng)內(nèi)掃描，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)綠原酸為324 納米， 儀器型號(hào)： 島津，LC-20A；綠原酸流動(dòng)相：乙睛：0.01%磷酸水溶液=20∶80；檢測(cè)波長(zhǎng)：324 納米； 流 速：0.8 毫 升/分 鐘； 柱 溫：35℃；色譜柱：ZORBAXEclipseXDBC184.6×150 毫米，5 微米； 進(jìn)樣量：20 微升。

1.6 蒲枳素中黃酮類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定

樣品中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取： 稱取發(fā)酵前、后蒲枳素各50 克，加入300毫升水，煮沸30 分鐘，將蒲枳素樣品殘?jiān)^(guò)濾掉， 則獲得蒲枳素樣品的粗提液，備用。

標(biāo)準(zhǔn)黃酮類(lèi)物質(zhì)配制： 用蘆丁代替黃酮類(lèi)物質(zhì)，稱取蘆丁，用甲醇將蘆丁稀釋成濃度為0.25 微克/毫升，備用。

檢測(cè)： 于200～700 納米波長(zhǎng)內(nèi)掃描，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)蘆丁為265納米，儀器型號(hào)：島津，LC-20A；綠原酸流動(dòng)相： 乙睛：0.01%磷酸水溶液=20∶80； 檢測(cè)波長(zhǎng)：324 納米；流速：0.8 毫升/分鐘；柱溫：35℃；色譜柱：ZORBAXEclipseXDB -C184.6 ×150 毫米，5 微米；進(jìn)樣量：20 微升。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲枳素發(fā)酵前、后成分變化

蒲枳素提取后， 注入高效液相色譜儀， 在色譜條件下進(jìn)行HPLC分析。 蒲枳素發(fā)酵后注入高效液相色譜儀， 在色譜條件下進(jìn)行HPLC分析。 比較蒲枳素發(fā)酵后的圖譜與未發(fā)酵蒲枳素的圖譜， 其絕大多數(shù)特征吸收峰的保留時(shí)間是一致的，也就是說(shuō)大部分物質(zhì)是一致的；并且在許多具有相同保留時(shí)間的吸收峰，峰高也大體一致，表明大部分物質(zhì)含量變化不大； 但是在一些具有相同保留時(shí)間的特征吸收峰上的物質(zhì)含量升高， 峰高達(dá)到發(fā)酵前制劑的數(shù)倍。

2.2 蒲枳素發(fā)酵前、后綠原酸含量

蒲枳素發(fā)酵前、 后綠原酸含量變化見(jiàn)表1，從表1 可以看出，發(fā)酵前蒲枳素中綠原酸含量0.92 毫克/克， 發(fā)酵后蒲枳素綠原酸含量增加為1.29 毫克/克， 蒲枳素發(fā)酵后，綠原酸含量比發(fā)酵前提高1.4 倍，或綠原酸含量提高40.2%。

2.3 蒲枳素發(fā)酵前、后黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁）含量

蒲枳素發(fā)酵前、 后黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁）含量變化見(jiàn)表2，從表2 可以看出， 發(fā)酵前蒲枳素中黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁）含量0.51 毫克/克，發(fā)酵后蒲枳素黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁）含量增加為1.33 毫克/克， 蒲枳素發(fā)酵后，黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁）含量比發(fā)酵前提高2.7 倍，或蘆丁含量提高160.78%。

表1 蒲枳素發(fā)酵前、后綠原酸含量

表2 蒲枳素發(fā)酵前、后黃酮類(lèi)物質(zhì)（蘆丁）含量

3 結(jié)論

3.1 發(fā)酵前、后蒲枳素液相色譜絕大多數(shù)特征吸收峰的保留時(shí)間是一致的， 也就是說(shuō)大部分物質(zhì)是一致的， 但是在一些具有相同保留時(shí)間的特征吸收峰上的物質(zhì)含量升高。

3.2 蒲枳素經(jīng)過(guò)發(fā)酵，與未發(fā)酵蒲枳素相比， 其有效成分綠原酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)有顯著增加。