外來捕食者克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙不同發育階段幼體表型與運動能力的影響

樊曉麗, 林植華

麗水學院生態學院, 麗水 323000

外來物種入侵常常極大地影響本土物種的生態系統功能,導致種群數量下降從而對生物多樣性構成重大威脅[1- 4]。克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦,原產于美國南部和墨西哥北部,國外稱之為紅沼澤螯蝦(Red swamp crayfish),目前它已被作為一種重要的水產經濟資源物種擴散到世界各地[5- 6]。我國于1929年由日本引進,現已在十幾個省市的河流、池塘、溝渠、水田等水體中形成野外種群,在部分地區已成為優勢種[7]。已有研究表明,克氏原螯蝦的入侵對本土的水生植物、無脊椎動物等生存造成了極大威脅,顯著降低引入地的生物多樣性,成為著名的入侵物種之一[8-10]。該物種通過直接捕食兩棲類卵和幼體,降低兩棲類幼體活動水平、改變成體的繁殖行為來阻止其成功交配以及產卵,破壞水生植物而使兩棲類的產卵場受到破壞,從而造成本土兩棲類種群數量下降[8- 13]。

獵物的行為或表型可塑性可能是其適應入侵性捕食者所導致的快速環境變化的關鍵機制[14- 15]。在長期的進化過程中,許多動物通過調節自身行為或產生防御性表型來躲避捕食者捕食或降低捕食壓力以保護自己免受或減少傷害的行為,這是生物體對生存環境的一種動態適應過程。已有研究表明,無尾兩棲類是研究捕食者誘導的行為與表型可塑性的最常見生物之一,兩棲類幼體既能直接感知捕食者誘導物,又能感知由受傷同種個體所釋放出的警報信息素來覺察捕食風險的存在[16],通過降低自身活動水平[17- 18]、形成集群[19]、改變微生境利用[20]、改變體型與體色[21- 22]、增加尾鰭的相對高度與遠端顏色[23- 26]、改變生活史[27],或者這些響應的各種組合,來避免被察覺或攻擊其尾鰭的末端而保護其體腔內的重要器官,從而提高其存活率降低被捕食的風險。對于入侵捕食者,許多無尾兩棲類幼體由于缺乏與入侵捕食者克氏原螯蝦的共同進化史,故不能識別捕食信號進而誘導產生適應性的行為與形態響應,這是克氏原螯蝦造成全球本土兩棲類數量下降的主要原因[9, 28, 29]。但是,某些無尾兩棲類幼體經過足夠長的共同進化時間,已經演化發展成先天具有覺察和避免克氏原螯蝦的能力[30- 31]。因此,學會識別入侵捕食者誘導物的能力對于棲息在入侵捕食者所形成的新生態環境中的兩棲類種群來說是非常關鍵。

對于無尾兩棲類來說,生活史的起點是受精卵,兩個關鍵生活史轉折點分別是幼體的孵出和變態,這兩個時期均能對捕食風險表現出一定程度的表型可塑性響應[32- 33]。研究表明,為了逃避被捕食無尾類往往付出提早孵化形成較小個體的即時代價[34- 37]。無尾類幼體早期發育過程中所經歷環境條件的影響可能從生活史的一個階段延續到隨后的發育階段,即孵化階段對捕食者所表現出來的表型可塑響應可能具有延滯效應(Carry-over effects),即能影響其變態后(如大小、形態或蝌蚪期)對捕食風險誘導的可塑響應,具體可通過改變蝌蚪期生長率和變態時間[38- 41]。目前許多研究主要集中來自無脊椎捕食者,如水蛭(Haemopsissanguisuga)和黃蜻幼蟲(Pantalaflavescens)的捕食風險對蝌蚪到變態這一發育階段的影響[42- 43],少量的研究關注克氏原螯蝦誘導的無尾兩棲類孵化期的表型變異以及如何影響隨后的蝌蚪期直到變態幼蛙的形態特征及運動能力。

黑斑側褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)隸屬于兩棲綱無尾目蛙科側褶蛙屬,通常在3至6月選擇在持久性池塘邊緣產下卵團,受精卵被強黏性的卵膠膜包裹著,窩卵數約為3000—5000枚[4,44],在其繁殖水體中同時生活著捕食無尾類卵和蝌蚪的克氏原螯蝦,故其幼體往往面臨克氏原螯蝦的捕食風險。本文試圖將黑斑側褶蛙受精卵暴露于不同捕食風險條件下,探討入侵捕食者克氏原螯蝦對中國南部麗水地區黑斑側褶蛙不同發育階段幼體的表型、運動能力及行為的短期和長期影響,從而為無尾兩棲類的反捕食機制和生物多樣性保護提供一定的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的采集

1.2 實驗設計與管理

隨機取出300枚受精卵按窩別平均分配到3個塑料箱(320 mm × 210 mm × 110 mm,80 mm水深)內。箱內捕食風險處理方法如下：空白對照組(NP：無捕食者處理)、實驗組1(EP1：捕食風險存在2 d)和實驗組2(EP2：捕食風險一直存在)。為了避免克氏原螯蝦直接捕食黑斑側褶蛙受精卵(或后續實驗中的蝌蚪),把其關在人工縫制的透明塑料網狀籠(直徑60 mm,網眼直徑1 mm)內,每48 h給籠內的克氏原螯蝦喂食6只黑斑側褶蛙蝌蚪,保證實驗組的水體溶液中存在同種受傷個體被捕食者捕食而由皮膚釋放出的示警刺激物,以此形成捕食風險[30]。整個實驗過程的氣候室溫度設為25 ± 1℃,光周期12L∶12D。

所有實驗組蝌蚪在同一天從卵膠質里孵化出來,即孵化期無明顯差異,此時孵出個體很脆弱,待其生長到第三天時,從每個實驗組隨機撈出40只蝌蚪進行形態特征測定。將蝌蚪輕輕移入底部有標尺的培養皿內,加入適量水,蝌蚪身體處于完全舒展狀態,用Sony DSC-T100數碼相機拍攝蝌蚪的俯視圖,用JmageJ 1.44p軟件測定蝌蚪的體長(吻端到泄殖腔的距離)、尾長(尾鰭基部到末端的距離)和尾肌寬(尾鰭基部肌肉的寬度)[41,45-46]。剛孵出蝌蚪常處于傾斜狀態且尾鰭發育狹窄,故無法測定尾鰭高和尾肌高。后將每個實驗組分成4個重復組,密度設為15只/箱(2.79只/L),保持原有捕食風險繼續飼養。

蝌蚪飼養過程中,每48 h粉質牛蛙飼料(0#,天邦牌特種水產配合飼料)進行充足喂食,避免食物水平對蝌蚪發育的影響。每周用曝氣24 h后的自來水進行完全換水,按一定順序調換塑料箱位置以減少位置形成的溫度差異影響。實驗期間,每天觀察克氏原螯蝦和黑斑側褶蛙蝌蚪的存活情況,替換死亡的克氏原螯蝦個體,若黑斑側褶蛙蝌蚪出現死亡,及時撈出后,用大小相似剪尾標記蝌蚪個體加以補充以保持密度不變(補樣個體不進行統計分析)。以黑斑側褶蛙蝌蚪出現一只前肢(42期)作為變態標志,從實驗開始到蝌蚪出現一只前肢所經歷的天數記為變態期。一旦開始出現,每天觀察3次,將每只變態個體及時撈出,單獨編號后置于盛有水深為5 mm的塑料杯內,杯口用網眼為1 mm的網布封住,避免幼蛙逃逸,待其尾部完全消失[46]。實驗結束后,所有剩余蝌蚪和幼蛙放回到采集水體中。

1.2.1黑斑側褶蛙蝌蚪的游泳能力與形態測定

第30天,通過水迷宮視頻跟蹤分析系統(Morris型,安徽正華生物儀器設備有限公司)檢測不同實驗組黑斑側褶蛙蝌蚪的游泳能力。測試時,每只蝌蚪在游泳池內(水溫約為25 ℃)適應1 min后,用柳樹枝條輕觸黑斑側褶蛙蝌蚪尾鰭基部使其快速游動,記錄黑斑側褶蛙蝌蚪在1 min內的疾游速(mm/s)、平均游速(mm/s)和總路程(mm)。運動測定后,拍攝蝌蚪俯視圖、側面圖測定其體長和尾長,用JmageJ 1.44p軟件測定蝌蚪的尾鰭高(尾鰭最高處的長度)和尾肌高(尾鰭基部肌肉的高度)[41]。

1.2.2黑斑側褶蛙蝌蚪的反捕食行為觀察

為了檢測捕食風險克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙蝌蚪活動水平的影響,每隔10天采取瞬間觀察法記錄不同實驗組內的蝌蚪行為,具體時間為4月1日、4月11日、4月21日、5月1日和5月11日。在30 min內每5 min記錄黑斑側褶蛙蝌蚪在水體中的活動狀況,當蝌蚪處于游動、擺尾和攝食時被認為處于活躍(游泳)狀態[18]。實驗操作時觀察者安靜坐在一側,保持安靜且不隨意走動,避免人為影響蝌蚪的活動。

1.2.3黑斑側褶蛙幼蛙的跳躍能力與形態測定

每只黑斑側褶幼蛙在室內(25 ± 1℃)內適應10—15 min后,將其放入1%的綠色食用色素溶液中浸濕其四肢,撈出后置于鋪有白色紗布的地面上,用柳樹枝條輕觸其尾桿骨來刺激其跳躍,至少讓每只幼蛙跳躍10次以上。通過涂料痕跡來確定跳躍長度,從上一個后肢印跡的末端到下一個后肢印跡的末端之間的距離為一個跳躍,測量出最長三次的跳躍距離(± 0.01 cm),求出平均值[46]。運動測定后,通過輕輕按壓幼蛙腹部使膀胱內尿液排空,用吸水紙吸干其體表水分,用Sartorius分析天平稱取體重(± 0.0001 g),數顯游標卡尺(± 0.01 mm)測定幼蛙體長(從吻端到尾桿骨之間的距離)[46]。

1.3 數據分析

用Statistica統計軟件包完成所有數據的統計分析。統計分析前,檢驗數據正態性(Kolmogorov-Smirnov test)和方差同質性(F-max test)。經檢驗,數據無需轉換符合參數統計的條件。用單因素方差分析(One-way ANOVA)、單因素多變量方差分析(One-way MANOVA)、兩因素方差分析(Two-way ANOVA)及后續的Tukey′s檢驗、線性回歸等處理和比較相應的數據。描述性統計值用平均值 ± 標準誤(Mean ± SE)表示,顯著性水平設置為α= 0.05。

2 結果

2.1 克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙剛孵出蝌蚪形態特征的影響

有捕食者和無捕食者處理下的黑斑側褶蛙剛孵出蝌蚪形態特征的統計性描述見圖1。One-way ANOVA結果表明,有無捕食者條件下黑斑側褶蛙孵出蝌蚪的形態差異顯著(Wilks λ=0.48,df=6, 76,P<0.0001)。進一步的Tukey′s test表明,捕食者長期存在條件下黑斑側褶蛙孵出蝌蚪的體長、尾長和尾肌寬均顯著短于無捕食者的空白對照組和捕食者僅存在2 d的實驗組(P<0.001),無捕食者、捕食者僅存在2 d的實驗組之間的剛孵出蝌蚪體長差異顯著(P<0.001),但尾長和尾肌寬差異不顯著(P>0.05,圖1)。

圖1 有無捕食者處理下,黑斑側褶蛙剛孵出蝌蚪的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of Pelophylax nigromaculata hatchlings under the presence and absence of predatorsNP表示無捕食者,EP1：捕食者處理2 d,EP2：捕食者一直處理,圖中數據用平均值 標準誤(范圍)表示,小寫字母表示組間差異顯著,a>b>c

2.2 克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙蝌蚪游泳能力與形態特征的影響

有捕食者和無捕食者處理下的黑斑側褶蛙蝌蚪游泳能力的統計性描述見圖2。One-way MANOVA結果表明,有無捕食者條件下黑斑側褶蛙蝌蚪的游泳能力組間差異顯著(Wilks λ=0.79,df=6, 320,P<0.0001)。進一步的Tukey′s test表明,長期捕食者存在條件下黑斑側褶蛙蝌蚪的游泳總路程和平均游速均顯著小于無捕食者和捕食者存在2 d的實驗組(P<0.001),無捕食者和捕食者存在2 d的實驗組之間差異不顯著(P>0.05)。疾游速的組間差異不顯著(P=0.265,圖2)。One-way ANOVA結果表明,運動能力所檢測的黑斑側褶蛙蝌蚪體長、尾長、尾鰭高、尾肌高的組間差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 有無捕食者處理下,黑斑側褶蛙蝌蚪的游泳能力Fig.2 Swimming ability of Pelophylax nigromaculata tadpoles under the presence and absence of predators

圖3 有無捕食者處理下黑斑側褶蛙蝌蚪的活動狀態 Fig.3 Active state of Pelophylax nigromaculata tadpoles under the presence and absence of predators

2.3 克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙蝌蚪活動狀態的影響

不同時間所測試蝌蚪活動狀態的兩因素方差分析(Two-way ANOVA)結果表明,測試時間(F4,44=6.98,P<0.001)、捕食者設置(F2,44=22.89,P<0.001)和兩因素的相互作用(F8,44=2.98,P<0.009)均顯著影響蝌蚪的活動頻次(圖3)。不同實驗時間,長期捕食者存在實驗組蝌蚪活動頻次均小于無捕食者和捕食者存在2 d的實驗組。無捕食者實驗組蝌蚪的活動頻次前期高于捕食者存在2 d的實驗組,后期低于捕食者存在2 d的實驗組。以檢測的時間序號為自變量(1—6),以與對照組的比值為因變量的線性回歸分析結果顯示,捕食者存在2 d實驗組蝌蚪活動頻次與檢測時間相關不顯著(r=0.52,F1, 4=1.48,P=0.291),長期捕食者存在實驗組蝌蚪活動頻次與檢測時間呈顯著的正相關(r=0.82,F1, 4=8.21,P=0.046)。

2.4 克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙蝌蚪的變態時間、大小和幼蛙跳躍能力的影響

有捕食者和無捕食者處理下的黑斑側褶蛙變態個體形態特征的統計性描述見圖4。單因素多變量方差分析(One-way MANOVA)結果表明,有無捕食者條件下黑斑側褶蛙的變態時間、體長和體重、跳躍距離差異顯著(Wilksλ=0.87,df=8, 240,P<0.05),Tukey′s test表明,無捕食者和捕食者存在2 d的實驗組黑斑側褶幼蛙的體長和體重均顯著小于有捕食者存在的情況(P<0.001),無捕食者和捕食者存在2 d的實驗組黑斑側褶幼蛙的體長和體重之間差異不顯著(P>0.05),而變態時間和幼蛙跳躍距離組間差異不顯著(P> 0.05,圖4)。

圖4 有無捕食者處理下黑斑側褶幼蛙的變態特征和跳躍能力Fig.4 Metamorphotic characteristics and jumping ability of Pelophylax nigromaculata juvenile under the presence and absence of predators

3 討論

3.1 黑斑側褶蛙蝌蚪對克氏原螯蝦捕食風險的行為響應

捕食作用是獵物行為的重要選擇壓力,行為可塑性在捕食者與獵物的交互過程中發揮了決定性作用,行為的協同進化對于本土獵物響應入侵捕食者威脅的適應性顯得尤為重要[30]。降低活動水平是棲息在水中的無尾類蝌蚪減少被捕食的最有效行為響應之一[18,19,47- 48]。本實驗過程中,黑斑側褶蛙蝌蚪能識別外來捕食者克氏原螯蝦同種個體示警誘導物而適應性地降低活動水平(圖3),無論示警誘導物是短暫還是持久接觸,即克氏原螯蝦捕食風險的存在顯著抑制了黑斑側褶蛙蝌蚪的活動水平,這與已有大多數研究是一致的[17- 18]。例如,西方鏟足蟾蜍(Pelobatescultripes)蝌蚪學會識別來自入侵捕食者克氏原螯蝦的化學誘導物,且相應地降低活動水平[31]。位于葡萄牙西南部的5種蝌蚪(Hylameridionalis、Hylaarborea、BufoBufo、Discoglossusgalganoi、Alytescisternasii)在克氏原螯蝦存在時同樣發生降低活動水平或空間回避行為[30]。類似的行為可塑性也發生在兩棲類幼體對其他入侵捕食者的行為反應[47]。雖然大多數研究是在實驗室內進行的,但是對同種受傷個體示警誘導物的反應也很可能發生在野外生境中[48]。克氏原螯蝦進入我國近90年,對于春季繁殖的黑斑側褶蛙來說,或許已經有足夠長的進化時間,兩棲類幼體對入侵捕食者的行為響應(在數十年內)比形態響應(可能需數百或數千年)進化可能更快些[29]。已有研究表明,Pelophylaxperezi蝌蚪從與受攻擊同種個體的示警物質的接觸中學會識別新的捕食者,對新的捕食風險發生行為響應,且能連續9天記住這些關系[49- 50]。因此,行為可塑性有助于降低黑斑側褶蛙蝌蚪受到外來捕食者克氏原螯蝦的傷害和緩解入侵物種對本土自然種群的影響。

3.2 黑斑側褶蛙幼體對克氏原螯蝦捕食風險的表型響應

捕食風險對無尾兩棲類胚胎發育的直接影響是改變孵出個體的表型。本研究結果表明,當長期存在克氏原螯蝦捕食風險時,黑斑側褶蛙孵出蝌蚪的體長、尾長和尾肌寬均顯著小于無捕食者的空白對照組和捕食者僅存在2 d的實驗組,這與已有大多數研究結果是一致的。例如,在捕食者水蛭(Haemopsissanguisuga)或潛水甲蟲(Dytiscusmarginalis)存在的情況下,Ranatemporaria均孵化成體長較小且尾鰭較短而深的蝌蚪[42,51]。類似地,三刺魚(Gasterosteusaculeatus)可誘導Ranaarvalis和R.temporaria孵化成較短尾鰭的蝌蚪[16]。

變態時間與大小是生活史復雜的無尾類的兩個重要適合度成分。大多數研究表明,無尾類蝌蚪往往通過加快發育(縮短變態時間)或降低生長率(即產生較小變態個體)來響應捕食風險的存在[52]。無尾類蝌蚪在權衡捕食風險代價時,往往采取降低活動水平來逃避捕食者,從而導致在時空上限制了覓食活動,大大減少了對其生長的能量投入[53]。本研究表明,來自克氏原螯蝦的捕食風險并沒有對黑斑側褶蛙蝌蚪的變態時間產生顯著影響,這與R.temporaria蝌蚪的變態時間也不受捕食者影響的結果一致[42]。無尾類孵化期對捕食風險產生的表型可塑性響應能對變態表型產生延滯效應,比如,在捕食者潛水甲蟲存在下R.temporaria發育成體長較短的幼蛙[42]。感到意外的是,本實驗與克氏原螯蝦捕食風險不存在或短暫存在相比而言,捕食風險長期存在下的黑斑側褶幼蛙的體長和體重反而更大些。可能的原因包括：(1)從生理角度看,無尾類個體發育早期所經歷的不利環境條件產生的不良影響通過隨后發育后期階段的補償性生長來抵消[54- 55]；(2)從行為角度來看,當存在捕食者克氏原螯蝦化學信號時,黑斑側褶蛙蝌蚪采取降低活動水平策略,在充分喂食條件下,更多的能量用于生長,行為可塑性的動態進化似乎對本土兩棲類適應外來捕食者起著決定性作用[56]；(3)從整個實驗過程來看,捕食風險長期存在組黑斑側褶蛙蝌蚪的相對活動水平與實驗時間呈顯著正相關,這表明黑斑側褶蛙蝌蚪的活動水平隨著生長時間的向后推進而變得越強烈,可能是由于不斷長大的蝌蚪個體重新評估了來自籠內的捕食風險信號,打破了最初由捕食風險導致的覓食活動的時空限制,從而形成較大的變態個體。因此,入侵捕食者克氏原螯蝦對黑斑側褶蛙幼體表型的長期影響是復雜可變的。

3.3 黑斑側褶蛙幼體對克氏原螯蝦捕食風險的運動能力響應

孵化階段對捕食風險的表型可塑響應可能會延續影響到后期生長階段個體的運動性能[54]。本研究結果表明,克氏原螯蝦捕食風險的長期存在顯著抑制了黑斑側褶蛙蝌蚪的游泳能力,主要表現在游泳耐力方面(包括游泳總路程和平均游速),而非疾游速(圖2)。克氏原螯蝦被認為是積極追逐型捕食者,故處于活躍狀態下的蝌蚪比不活躍狀態下遭受被捕食風險相對小些[29]。這表明黑斑側褶蛙蝌蚪能在運動能力上對克氏原螯蝦的捕食方式作出適應性響應。另外,來自克氏原螯蝦的捕食風險對黑斑側褶蛙變態幼蛙跳躍能力不產生影響,這與已有研究結果一致。例如,與歐洲醫蛭(H.sanguisuga)一同飼養的R.temporaria蝌蚪發育成較小的幼蛙,但并不影響幼蛙的跳躍能力[42]。也有研究表明,捕食風險造成的無尾類孵出幼體表型變異降低幼蛙的運動能力[51]。

本研究表明了黑斑側褶蛙蝌蚪能夠感知來自入侵捕食者克氏原螯蝦的捕食風險,誘導產生較小的孵出個體、蝌蚪較低的活動水平,但這種不足可通過后期補償生長,不影響進入陸地生境的變態個體的表型與運動能力。據此可推測,黑斑側褶蛙蝌蚪這種識別能力和適應性響應可能有助于緩解外來捕食者克氏原螯蝦對其自然種群的影響。

致謝：符曉雯、吳飛玲參與實驗動物的管理、行為觀察、形態特征和運動能力的測定。