鐵皮石斛種子液體靜置培養及其對離體植株生長的影響

董志淵，李林玉，馬維思，楊 斌，王 馨，嚴世武，楊麗英

(云南省農業科學院藥用植物研究所, 云南 昆明 650205)

【研究意義】鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬附生植物，產于中國浙江、安徽、云南、廣西、四川等地，生于海拔1600 m山地半陰濕的巖石上[1]。鐵皮石斛以莖入藥，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[2]。鐵皮石斛等石斛屬植物的種子在果實成熟時仍處于原胚階段，沒有胚根、胚軸、胚芽和子葉的分化，在自然條件下，需要共生菌提供營養促進萌發，但萌發率較低[3-5]。采用無菌萌發技術，播種石斛種子在滅菌的培養基上，可顯著提高種子的萌發率[6]。種子無菌萌發及離體繁殖已成為鐵皮石斛種苗規模化生產的主要途徑。【前人研究進展】目前，鐵皮石斛種子無菌萌發，主要采用固體培養基[7]。史俊和趙榮[8]研究發現，轉速120 r/min 的振蕩液體培養，可促進鐵皮石斛種子的無菌萌發和原球莖的生長，解決了固體培養存在的播種量小、繼代轉接工作量大等問題。【本研究切入點】本實驗前期研究發現，鐵皮石斛種子在靜置的液體培養液中也能萌發形成原球莖。但關于液體靜置培養對原球莖發育及其離體植株生長的影響尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】采用液體培養基，靜置培養鐵皮石斛種子，研究不同基本培養基對種子萌發、原球莖發育的影響以及來自不同液體培養基的原球莖及其體積大小對鐵皮石斛離體植株生長的影響，為優化鐵皮石斛液體培養提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)蒴果產自浙江省樂清市，果莢飽滿，顏色為黃綠色，未開裂，外表無病斑。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液體靜置培養 蒴果沖洗干凈后，超凈工作臺上70 %乙醇浸泡30 s，4.0 %次氯酸鈉溶液浸泡消毒20 min，無菌水沖洗3次，切除蒴果兩端，從中間切開蒴果，分為2份，分別將種子撒入50 mL液體培養基中進行培養。培養基分別為1/2B5、1/2N6、1/2MS、1/2花寶1號、1/2花寶2號等5種基本培養基，均加入NAA 0.5 mg/L、水解酪蛋白1 g/L、蔗糖30 g/L。培養基pH值5.8～6.2。培養條件為溫度25 ℃，光照強度4800 lx，光照時間10 h/d。

培養過程中，每10 d觀察鐵皮石斛種子萌發生長情況。培養40 d，顯微測量種子萌發形成原球莖的直徑。每種培養基設置3個重復，每個重復測量約300個原球莖的直徑。以直徑長度每200 μm 為單位，將原球莖劃分為6組。按如下公式統計原球莖直徑分布情況。

某一組的原球莖比例 (%)= (該組原球莖數目 ÷ 測量原球莖數目)× 100

1.2.2 原球莖分選和培養 采用滅菌的30目(篩孔600 μm)、40目(篩孔425 μm)的金屬篩，將1/2B5、1/2N6、1/2MS培養基培養獲得的原球莖依次過篩分級，并懸浮于無菌蒸餾水中，分別吸取原球莖懸浮液，轉接至固體培養基。每瓶固體培養基約400個圓球莖。固體培養基配方均為1/2MS + 水解酪蛋白1 g/L + NAA 0.5 mg/L + 活性炭2 g/L。培養90 d后，觀察不同處理(液體培養基、原球莖大小)，離體植株的形態特征。按如下公式統計不同形態類型的比例。

某一形態類型的比例 (%)= (該形態類型數目 ÷ 離體植株數目)× 100

1.2.3 數據分析 采用DPS統計軟件，對測量數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對鐵皮石斛種子萌發生長的影響

鐵皮石斛種子液體靜置培養過程中，基本培養基對種子萌發影響明顯。1/2B5和1/2N6培養基，種子培養10 d，明顯膨大，顏色持續變綠；培養20 d時，肉眼觀察到原球莖的形成；培養40 d時，大部分種子發育形成原球莖(圖1)。1/2MS培養基中，種子發育進程明顯慢于1/2 B5和1/2 N6培養基，但培養40 d也可形成原球莖。1/2花寶1號培養基和1/2花寶2號培養基，部分種子不能正常萌發，而發育形成的原球莖顏色普遍呈黃白色，出現原球莖畸形的情況。

測量原球莖直徑，1/2B5、1/2N6、1/2MS、1/2花寶1號和1/2花寶2號培養基，種子發育形成原球莖的直徑依次是438.56、577.89、401.03、348.58和336.56 μm，1/2N6培養基培養的原球莖直徑最大，而1/2花寶2號培養基的原球莖直徑最小。方差分析結果表明，不同培養基的原球莖直徑差異極顯著(P= 0.00 < 0.01)，1/2N6培養基的原球莖直徑顯著大于1/2MS、1/2花寶1號、1/2花寶2號培養基。

分析不同培養基原球莖直徑分布情況，結果表明，1/2B5培養基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為91.24 %(圖2)；1/2N6培養基中，原球莖直徑主要在400～800 μm，所占比例為81.30 %(圖3)；1/2MS培養基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為95.90 %(圖4)；1/2花寶1號培養基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為99.20 %(圖5)；1/2花寶2號培養基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為98.84 %(圖6)。

2.2 離體植株的形態特征

將1/2B5、1/2N6、1/2MS液體培養基培養40 d產生的原球莖，轉接到固體培養基上(圖7-1)。培養90 d，原球莖發育形成離體植株(圖7-2)。依據形態特征可分為3種類型：發育形成1～3片葉片和1～3個根，具單芽的正常植株(圖7-3)；具2個以上芽的多芽植株(圖7-4、圖7-5、圖7-6)；原球莖愈傷組織化，未形成植株(圖7-7、圖7-8)。統計不同形態類型的比例，結果表明，來自1/2N6培養基的原球莖，發育形成正常單芽植株比例較高，1/2B5培養基的原球莖發育形成多芽植株比例較高，1/2MS培養基的愈傷組織比例較高；直徑大于30目的原球莖發育形成正常單芽植株比例普遍高于40目的原球莖，相應地多芽植株、愈傷組織比例較低(表1)。

圖1 液體靜置培養獲得的原球莖Fig.1 Protocorms derived from static liquid culture

圖2 1/2 B5培養基的原球莖直徑分布情況Fig.2 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2B5 medium

圖3 1/2 N6培養基的原球莖直徑分布情況Fig.3 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2N6 medium

圖4 1/2 MS培養基的原球莖直徑分布情況Fig.4 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2MS medium

圖5 1/2花寶1號培養基的原球莖直徑分布情況Fig.5 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2Hyponex No.1 medium

圖6 1/2花寶2號培養基的原球莖直徑分布情況Fig.6 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2Hyponex No.2 medium

方差分析結果表明，液體基本培養基對正常的單芽植株比例影響不顯著(P= 0.35 >P0.05)，而原球莖大小對單芽植株比例有極顯著影響(P=0.00

1: 轉接在固體培養基上的原球莖；2: 原球莖發育形成離體植株；3: 單芽植株；4～6: 多芽植株； 7～8: 愈傷組織.1: Protocorms on solid medium; 2: Plantlets deriving from protocorms; 3: Single bud; 4-6: Multiple bud; 7-8: Callus deriving from protocorm圖7 原球莖離體培養形成的植株形態特征Fig.7 Morphology of plantlets derived from protocorms in vitro

3 討 論

植物細胞或組織液體培養一般采用振蕩培養的方式[9-11]。液體振蕩培養的鐵皮石斛原球莖重量極顯著高于固體培養[12]。采用液體靜置培養方式，鐵皮石斛種子能萌發形成原球莖，且轉接在固體培養基上可生長發育為離體植株。液體靜置培養簡化了石斛液體培養條件，有望加快液體培養在石斛人工繁育生產中的應用。

表1 原球莖發育形成的植株類型Table 1 Mythological types of plantlets derived from protocorms

4 結 論

鐵皮石斛種子液體靜置培養中，基本培養基是影響原球莖發育的重要因素，1/2N6是較適宜的培養基；來自不同液體培養基的原球莖及其大小顯著影響離體植株的生長，大于30目的原球莖發育形成正常單芽植株比例較高。