硒對砷致雄性小鼠睪丸組織損傷的修復作用

武曉英，喬宏萍，劉桂蘭，曹貴東

（1.太原師范學院生物系，山西晉中030619；2.天津渤海農牧產業聯合研究院有限公司，天津300308；3.山西瑞象生物藥業有限公司，山西太原030032）

砷中毒可以抑制體內抗氧化酶的功能，使細胞的分裂和增殖紊亂，引起機體氧化損傷[1]，進而導致細胞死亡[2-3]。全世界有超過20個國家因高砷水源而引起砷中毒，我國也是受飲水型砷中毒危害最嚴重的國家之一[4-5]。砷污染是一個不容忽視的公共衛生問題[6-7]，在世界范圍內嚴重危害著機體健康。砷中毒可直接損傷雄性生殖細胞的結構和功能，致使雄性生殖功能障礙、精子質量下降、繁殖性能受到嚴重影響[8-9]。硒（Se）是人體和動物必需的微量元素，具有對抗自由基，保護蛋白質、DNA以及染色質的結構和功能免受氧化損傷的能力[10]。硒和雄性動物的生殖關系也非常密切，它以硒蛋白的形式參與精子的發生過程和睪丸的正常發育。已有研究報道，硒的補充有效改善了雞的精液品質，精子畸形率顯著降低[11]。硒對重金屬的毒性具有緩解作用，它有效改善了鎘引起的氧化應激，提高了雞免疫系統的防御能力[12]。目前，砷對睪丸發育的毒性研究已有大量報道[8-9]，但硒對砷中毒引起的睪丸毒性緩解作用并不清楚。

本試驗選用昆明小鼠作為試驗對象，采用砷飲水染毒處理并灌胃硒，通過小鼠抗氧化力、睪丸組織細胞的凋亡等檢測，為硒對砷誘導的睪丸損傷緩解的作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

選取4～6周齡，體質量20～22 g的雄性昆明小鼠18只用于試驗。小鼠購自山西醫科大學實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 18只健康的小鼠隨機分為3組，每組6只連續稱質量記錄，分別為對照組（C組）、砷組（A組）和砷硒聯合組（A＋Se組）。

小鼠預飼7d，之后進入試驗期。3組小鼠自由采食，C組飲用蒸餾水，A組和A+Se組飲用含50mg/kg砷（As2O3）的蒸餾水，C組和A組每天1次灌胃0.5 mg/kg蒸餾水，A＋Se組每天1次灌胃0.5 mg/kg亞硒酸鈉。連續處理60 d，試驗結束后稱小鼠體質量，同時解剖小鼠稱睪丸組織質量。采用摘眼球法取小鼠血液析出血清凍存于-20℃冰箱，以測定抗氧化性能，同時解剖小鼠睪丸組織，制備切片用于組織病理學檢測。

1.2.2 小鼠血清、睪丸組織抗氧化指標檢測 小鼠血液樣品析出血清后直接進行氧化指標檢測；睪丸組織依據南京建成生物工程研究所提供的操作方法，用生理鹽水制備10%的組織勻漿，離心取上清檢測總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化力（T-AOC）活性及丙二醛（MDA）含量。

1.2.3 精子形態學觀察 收集附睪中的精液，經離心獲取精子，稀釋至適當濃度后采用巴氏染色法制片進行觀察，每個樣品連續計數200個精子，測定精子畸形率。

1.2.4 小鼠睪丸組織HE切片制備 小鼠睪丸組織采用常規方法進行石蠟包埋后切片觀察。病理切片制備過程為：10%中性甲醛溶液固定；乙醇梯度脫水；60～65℃下組織樣品浸蠟；石蠟組織包埋；切片機切片；58～60℃烘干機烘片30～60 min；二甲苯脫蠟；蘇木素伊紅染色；乙醇梯度脫水封片；觀察，拍照。

1.2.5 小鼠睪丸組織的TUNEL檢測 小鼠睪丸組織用甲醛固定并制備石蠟切片，切片利用地高辛標記凋亡細胞DNA的3′-OH末端，通過生物素標記的抗地高辛抗體反應再結合SABC，最后加入DAB顯色，于顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.3 數據分析

使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對細胞凋亡TUNEL結果進行分析，每個樣本觀察不少于5個視野，并計數陽性細胞數。試驗數據用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，然后用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 砷、硒對小鼠體質量和睪丸組織質量變化的影響

在60 d的試驗期，C組與A＋Se組小鼠飲食與生長發育良好，A組則從砷處理的第3周開始，食欲下降，生長遲緩，出現嚴重掉毛現象。從表1可以看出，C組小鼠體質量雖高于A＋Se組，但差異不顯著（P＞0.05），C組和A＋Se組小鼠體質量均顯著高于A組小鼠（P＜0.05）；A組小鼠睪丸組織質量極顯著低于C組（P＜0.01），顯著低于A＋Se組（P＜0.05）。

表1 不同組別小鼠體質量和睪丸組織質量比較 g

2.2 砷、硒對小鼠血清中抗氧化指標的影響

從表2可以看出，A＋Se組小鼠血清中T-SOD和GSH-Px的活性顯著高于C組（P＜0.05），極顯著高于A組（P＜0.01），A組活性顯著低于C組（P＜0.05）；比較不同組別小鼠血清中T-AOC的活性，A+Se組極顯著高于A組和C組（P＜0.01），C組顯著高于A組（P＜0.05）；A＋Se組小鼠血清中MDA含量顯著高于C組（P＜0.05），極顯著低于A組（P＜0.01）。

表2 不同組別小鼠血清中抗氧化指標比較

2.3 砷、硒對小鼠睪丸組織抗氧化性能的影響

從表3可以看出，不同組別小鼠睪丸中T-SOD和GSH-Px的活性，A＋Se組顯著高于C組（P＜0.05），極顯著高于A組（P＜0.01），A組活性顯著低于C組（P＜0.05）；不同組別小鼠睪丸中T-AOC的活性，A＋Se組極顯著高于A組和C組（P＜0.01），C組顯著高于A組（P＜0.05）；A＋Se組小鼠睪丸組織中MDA含量顯著高于C組（P＜0.05），極顯著低于A組（P＜0.01）。

表3 不同組別小鼠睪丸組織抗氧化性能比較

2.4 砷、硒對小鼠精子畸形率的影響

從表4可以看出，C組小鼠附睪中沒有完全缺陷型精子，A組和A＋Se組小鼠附睪中都有完全缺陷型精子，A組極顯著高于A＋Se組（P＜0.01），A＋Se組小鼠精子畸形率極顯著低于A組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；所有組別中畸形率發生最高的種類是頸部和中段缺陷。

表4 不同組別小鼠精子畸形率比較

2.5 砷、硒對小鼠睪丸組織HE染色與細胞凋亡的影響

由圖1可知，C組睪丸組織中生精小管結構完整，生精上皮細胞排列規則，管腔大小均勻，管內有大量成熟精子，未見脫落細胞；A組為染砷組，生精小管形態結構受損，細胞排列松散，管腔增大，生精細胞和成熟精子數量減少，管腔內出現脫落細胞；A＋Se組為砷染毒同時聯合添加硒組，與A組比較生精細胞數量增加，形態結構相對完整，對砷的毒性起到明顯的拮抗作用。

從圖2～3可以看出，A組小鼠睪丸組織細胞凋亡數量極顯著高于C組與A＋Se組（P＜0.01），C組睪丸組織凋亡細胞數量雖低于A＋Se組，但差異不顯著（P＞0.05）。A組睪丸組織中除精原細胞外，初級精母細胞和睪丸間質細胞也發生細胞凋亡。

3 結論與討論

3.1 硒對砷染毒小鼠血清及睪丸組織抗氧化性能的影響

重金屬元素可以引起氧化應激反應[13-14]，刺激機體產生大量的活性氧（ROS），破壞氧化系統和抗氧化防御系統之間的平衡，平衡一旦被破壞就會直接或間接損傷細胞內各種成分，組織受到氧化損傷。氧化應激也是砷毒性的重要原因[15]。LIU等[16]研究發現，鉛能引起大鼠肝臟氧化應激。硒可以通過拮抗重金屬元素保護機體，主要體現在能提高機體抗氧化系統中超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等重要抗氧化酶的活性[17]，保護細胞化合物免受ROS誘導的損傷[10]，維持蛋白質和DNA的結構以及功能的穩定。在小鼠鉛中毒的研究中發現，硒能有效地緩解鉛對小鼠造成的神經毒性[12]。本試驗中，C組和A＋Se組小鼠的生長發育狀態良好。A組小鼠3周之后表現為食欲下降、生長緩慢和掉毛的現象。通過檢測各項抗氧化指標，A組小鼠血清和睪丸中T-SOD、GSH-Px和T-AOC的活性明顯降低，添加硒后，A＋Se組小鼠血清與睪丸中SOD、GSH-Px和T-AOC的活性極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；檢測指標中的MDA是ROS破壞生物膜不飽和脂肪酸發生過氧化的產物。試驗結果顯示，A組小鼠生物膜受損嚴重，MDA含量極顯著高于C組與A＋Se組（P＜0.01）。

3.2 硒對砷染毒小鼠睪丸組織細胞凋亡和精子形態的影響

細胞凋亡亦稱細胞程序性死亡，是生命的基本現象，通過對凋亡機制的闡明可以揭示許多生理和病理現象的本質[13，18-19]。在精子發生過程中，生成的精子和死亡精子之間的動態平衡維持了精子的正常數量，由生精細胞的正常凋亡來維持。然而，生精細胞過度凋亡則可造成睪丸發育不全、精子發生異常，導致雄性不育[20]。氧化應激是砷致雄性生殖毒性及雄性不育的重要原因[15]。有研究表明，砷暴露會損傷小鼠睪丸結構、誘導睪丸氧化應激，減少附睪精子，引起精子發生障礙[21-23]。

本試驗中，A＋Se組睪丸組織HE染色的結果顯示，生精細胞數量較A組增加，形態結構較完整，明顯對砷的毒性起到拮抗作用；而且細胞凋亡檢測結果顯示，A＋Se組睪丸組織中的細胞凋亡數目極顯著低于A組，凋亡只發生于精原細胞，初級精母細胞和睪丸間質細胞沒有發生細胞凋亡。