中華蜜蜂氣味受體AcerOr1基因啟動子克隆及序列分析

郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；3.山西農業大學工學院，山西太谷030801）

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是我國特有的蜜蜂品種，它們善于利用零星蜜粉源，對山區和低溫開花植物授粉有著非常重要的作用，而中華蜜蜂的傳粉行為與其嗅覺系統中相關蛋白的功能有著密切的關系。其嗅覺感知的起始是由表達在嗅覺受體神經元（ORNs）上的特異性的氣味受體識別周圍環境中的氣味分子并被激活，氣味分子與其同源的氣味受體Ors匹配激活信號轉導級聯反應，控制與氣味相關動作電位產生的強度和時間。氣味受體的一個主要功能是對氣味的識別和編碼，氣味受體具有識別氣味分子并將胞外化學信號轉換為電信號，并從嗅覺感覺神經元向大腦發送電信號，導致ORNs產生動作電位。有關蜜蜂氣味受體的研究，最早是KRIGER等發現的意大利蜜蜂（Apis mellifera）AmelR2[1]，它與果蠅Or83b和岡比亞按蚊AgOr7同源，表達于觸角毛型感器和板形感器中。隨后從意大利蜜蜂基因組中鑒定出177個Ors[2]，東方蜜蜂（Apis cerana）全基因組測序鑒定出119個Ors[3]。與其他昆蟲相比，蜜蜂的氣味受體基因數量較多，這與蜜蜂和花之間的化學通訊及蜜蜂群體內化學通訊存在著密切的關系[4]。

趙慧婷[5]在中華蜜蜂中克隆并鑒定出一個傳統的氣味受體 AcerOr1（GenBank 登錄號：JN544932），發現AcerOr1在工蜂和雄蜂不同發育階段的觸角中均有表達，表明AcerOr1可能參與了性別和分工嗅覺感知過程。但是中華蜜蜂AcerOr1基因的表達和分子機制尚不清楚，因此，本研究借助當前基因組學及之前研究提供的數據，對中華蜜蜂AcerOr1基因的啟動子結構及其潛在的調控序列進行了分析和推測，為深入研究AcerOr1在中華蜜蜂嗅覺中的功能提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）采集于山西農業大學中蜂實驗場。ExTaq DNA聚合酶、限制性內切酶、pMD18－T Vector載體、T4 DNA Polymerase等均購自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購自Axygen公司，Genomic DNAIsolation Kit購自Biovision。

1.2 中華蜜蜂基因組DNA的提取

按照Genomic DNAIsolation Kit說明書提取。

1.3 特異性引物的設計及染色體步移擴增

根據Genebank上中華蜜蜂（Apis cerana cerana）氣味受體（odorant receptors）AcerOr1基因cDNA序列（JN544932）分別設計引物 1、2（表 1），與 2 個接頭引物AP1、AP2形成巢式引物，進行第1次步移擴增。將得到的目的片段連接到pMD18－T載體上，送去測序。根據第1次擴增的啟動子序列，繼續設計引物3、4（表1），進行第2次步移并測序。

表1 引物序列

1.4 目的片段回收、片段與載體連接、轉化及測序

根據電泳檢測擴增結果，使用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段連接至pMD18－T Vector，并轉化E.coli進行鑒定和篩選，將含有目的基因重組子的菌株送至華大基因進行測序。

1.5 生物信息學分析

用DNAMAN等生物學軟件對序列進行處理，然后將測序獲得的啟動子序列提交至http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/、http：//www.cbrc.jp/research/d b/TFSEARCH.HTML進行在線分析，預測啟動子序列保守區域中潛在的順式作用元件。通過McPromote在線工具預測其轉錄起始位點。用在線工具CpGIsland Searcher（http：//www.usenorris.com/cpgial ands2/cpg.aspx）預測中華蜜蜂AcerOr1基因是否含有CpG島以及CpG島位置。

2 結果與分析

2.1 AcerOr1啟動子測序及分析

為了判斷該產物是否與AcerOr1基因相關，將獲得的1 831 bp序列登錄NCBI并BLASTn分析，結果發現，該序列的3′端與已有的中華蜜蜂AcerOr1基因序列的5′端部分同源率達到92%，而1 673 bp的5′端序列部分在GenBank數據庫中沒有同源片段（圖1），表明該片段是中華蜜蜂AcerOr1基因5′端的側翼序列。

用DNAMAN軟件將所克隆的中華蜜蜂AcerOr1啟動子進行分析。由圖1可知，目的片段1 831 bp，去除158 bp重疊序列后，剩余1 673 bp為中華蜜蜂AcerOr1基因啟動子區域序列，該序列中堿基A比例為34.2%，堿基T比例為33.7%，堿基C比例為16.7%，堿基G比例為15.4%，AT含量較高，占67.9%；GC含量占32.1%，相差35.8百分點（表2）。通過CpG Island Searcher工具預測，發現擴增的中華蜜蜂AcerOr1基因5'側翼調控區域沒有符合條件的CpG島，對獲得的AcerOr1基因啟動子進行轉錄起始位點預測，在1100～1139bp處存在基礎啟動子，其序列為：5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAA AATGATTCATAAGT-3′。通過McPromote預測中華蜜蜂AcerOr1轉錄起始位點可能位于翻譯起始位點ATG上游621 bp處的堿基T，將此位點標記為＋1，其可能性為0.98（圖2）。

表2 中華蜜蜂AcerOr1基因啟動子區域堿基組成

2.2 AcerOr1啟動子轉錄因子分析

表3 作用元件種類及功能

在上游正鏈、下游負鏈不同的位置上分別有3個TATA-Box和 10個CAAT-Box，3個TATA-Box分別位于上游-292、-880 bp處，下游182 bp。應用在線轉錄因子結合位點預測程序（Http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.HTML）進一步分析還發現，AcerOr1基因啟動子序列中含有眾多其他元件，如與環境應激相關的元件熱激蛋白因子HSF（AGAAA）；與胚胎發育或組織發育相關的元件：細胞因子CF2-II（TATATATA）、氮調控基因NIT2（TATCAA）、轉錄激活因子CdxA（ATTTATA）。通過這些作用元件，可以初步認為克隆得到的DNA片段為具有調控功能的啟動子序列（圖2、表3）。

3 結論與討論

本研究克隆到的中華蜜蜂組織特異性AcerOr1基因啟動子大小為1 673 bp，片段內AT堿基含量較高，占67.9%。真核生物的啟動子相對復雜，位于結構基因5′端上游區域，在其指導下RNA聚合酶全酶和模板可以正確的結合并被活化，從而使基因轉錄啟動。典型的真核生物啟動子主要包括起始密碼子、TATA框、GC框、CAAT框等，其中，起始密碼子和TATA框又稱為核心啟動子，是RNA聚合酶II重要的識別位點，能夠使酶準確地識別轉錄起始位點并開始轉錄，保證轉錄得以精確起始[10]，對轉錄的起始具有重要的作用。本試驗獲得的中華蜜蜂AcerOr1基因啟動子TATA-Box分別位于上游-292、-880 bp處，下游182 bp，符合真核生物5′-TATA[A/T]A[A/T]-3′模式[11]。CAAT-Box與 TATA-Box同樣是真核基因啟動子上游調控元件，控制著轉錄的起始頻率。本試驗10個CAAT-Box表明該序列可能具有較高的啟動頻率，但是大部分距離轉錄起始位點較遠，能否增強AcerOr1基因的轉錄效率還有待進一步研究。

生物信息學分析在基因5′端調控區轉錄子和啟動子分析中已經得到廣泛的應用[12]。本研究利用啟動子在線分析軟件，研究了中華蜜蜂氣味受體AcerOr1基因5′側翼區的各種轉錄因子結合位點，包括與環境應激相關的元件熱激蛋白因子HSF（AGAAA）；與胚胎發育或組織發育相關的元件：細胞因子 CF2-II（TATATATA）[6]、氮調控基因 NIT2（TATCAA）、轉錄激活因子CdxA（ATTTATA）。由以上預測出的與胚胎發育或組織發育和環境應激相關的順式作用元件，推測可能是一個與生長發育和逆境脅迫有關的啟動子。蜜蜂和其他的昆蟲一樣，屬于變溫動物，環境溫度能直接影響其體溫的高低變化和生命過程。sHSPs是昆蟲抵御低溫損傷的成員之一，研究發現sHSPs基因的表達能提高果蠅在低溫環境下的生存率[13]。sHSPs在夜蛾Spodoptera litura和美洲斑潛蠅Liriomyza sativae滯育期表達升高，證明sHSPs與抗低溫脅迫有關[14]。sHSPs除了作為分子伴侶保護昆蟲在極端低溫、氧化、紫外線等不利環境條件下免受組織細胞損傷，還可以參與穩定細胞骨架、保護細胞膜完整性、重組細胞核、抑制細胞凋亡及參與生物體的生長、發育和衰老過程。而熱激蛋白基因的表達受蛋白因子HSF的調節。中華蜜蜂嗅覺敏銳，抗寒耐熱，善于利用零星蜜粉源，其作為特殊的特種經濟動物，近年來備受人們關注。

通過本試驗可以初步認為，中華蜜蜂AcerOr1基因的 5′側翼序列是一個具有 TATA-Box、CAAT-Box的典型真核生物啟動子，有一個轉錄起始位點，通過CAAT-Box控制轉錄起始頻率。AcerOr1基因啟動子序列中還含有眾多其他元件，如與環境應激相關的元件熱激蛋白因子HSF（AGAAA）；與胚胎發育或組織發育相關的元件：細胞因子 CF2-II（TATATATA）、氮調控基因 NIT2（TATCAA）、轉錄激活因子 CdxA（ATTTATA），表明AcerOr1基因在中華蜜蜂體內的轉錄和表達可能受到胚胎、組織及外界環境的調控。該啟動子的獲得，為下一步通過轉基因鑒定啟動子活性及各種調控元件的作用奠定了基礎。