高效液相色譜法測定大豆維生素E方法的優化

趙 霞 ，曹改萍，王 敏，岳愛琴，張永坡，高春艷，牛景萍 ，趙晉忠 ，杜維俊

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.山西省農業種子總站，山西太原030000；3.山西農業大學文理學院，山西太谷030801）

維生素E又稱生育酚，分子式為C29H50O2，是透明淡黃色黏稠油狀物。天然維生素E含有8種異構體，因其取代基的數量和位置不同，一般分為生育酚和三烯生育酚2類，分別為α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和α-三烯生育酚、β-三烯生育酚、γ-三烯生育酚、δ-三烯生育酚，在外界環境下不穩定，容易受光、氧氣等影響被氧化破壞，所以，準確測定分析生育酚較為困難。

樣品前處理是分析檢測的前提條件，前處理由于工作量大、耗時長，很大程度上決定了整個分析檢測的優劣[1-4]。近年來，食品中天然維生素E提取方法發展迅速，主要方法有皂化法[5-8]、溶劑提取法[9]、加壓溶劑提取法[10-11]、超臨界流體萃取法[12-13]、超聲波萃取法、固相萃取法[14-15]等，其中，超聲波萃取法的優勢在于能促進并加速維生素E的提取過程，而且可避免高溫對維生素E組分的破壞，特別是對固體樣品前處理更有利。

大豆等雙子葉植物中只含有4種生育酚，由于β-生育酚含量極低，且不易與γ-生育酚分離，因此，一般把（γ＋β）-生育酚含量算作γ-生育酚含量。目前，測定維生素E的方法主要有比色法[16]、紫外分光光度法[17]、紅外光譜法[18]、熒光法[19]、氣相色譜法[20]、液相色譜法[21-22]等。每種方法各有其優缺點。目前采用最多的是高效液相色譜法（HPLC），它具有靈敏度高、分離效果顯著、重復性好等優點[23]。

維生素E是人體維持多種生理活動不可替代，又不能自身合成，必須從外界攝取的營養元素，是一種天然的抗氧化劑。天然維生素E主要存在于以大豆為代表的油料作物中。隨著人們對身體健康、生活質量的關注程度不斷提高，對天然維生素E的研究將成為當今時代的一個熱門課題和大豆未來研究的重要方向。目前，國內外關于維生素E對人體健康的作用報道較多，但植物樣品中天然維生素E檢測方法的文獻不多，而天然維生素E各組分結構復雜，異構體種類多，因此，急需找到一種簡單、高效、準確的測定方法。

本研究在查閱國內外文獻基礎上，采用目前最先進的方法，對大豆維生素E提取方法及測定方法進行優化，旨在為大豆育種種質資源篩選和培育富含維生素E大豆新品種提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為武鄉小黑豆，由山西農業大學遺傳與種質創新實驗室提供。

1.2 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀，型號為1260，購于美國Agilent公司；震動球磨儀，型號為GT200，購于北京格瑞德曼公司；真空冷凍干燥機，型號為ATS.D5-2M，購于北京科儀公司；超聲波清洗器，型號為KM-300DE，購于昆山美美超聲儀器有限公司；平行濃縮儀，型號為MultiVap-8，購于美國LabTech公司；旋渦混合器，型號為QL-901 Vortex，購于江蘇其林貝爾公司。

α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品，每種純度均≥98%，購于美國Solarbio公司；甲醇，為HPLC級，購于美國Tedia公司；抗壞血酸、乙醇、正己烷，為分析純，購于康為世紀生物科技有限公司。

1.3 大豆維生素E提取方法的優化

將大豆籽粒置于-20℃冰箱中24 h，再放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，之后將樣品使用球磨儀磨成粉密封保存備用。

1.3.1 大豆維生素E提取的單因素試驗 試驗方法在參考李海燕[24]的方法上進行優化。具體步驟為：（1）準確稱取大豆粉 0.100 0 g；（2）分別加入 0、0.025、0.050、0.075、0.100 g 抗壞血酸；（3）分別加入3 mL 50%、60%、70%、80%、90%乙醇；（4）振蕩混勻10 s后，超聲提取 5、10、15、20、25 min；（5）加入 6 mL正己烷；（6）振蕩混勻 20 s后，超聲萃取 15 min；（7）取出后12 000 r/min離心8 min；（8）取上清液使用平行濃縮儀用N2將上清液吹干，復溶于1 mL甲醇中備用。

1.3.2 大豆維生素E提取的正交試驗 本試驗以抗壞血酸的量、提取時間、提取液乙醇濃度作為正交設計的3個因素，每個因素設置4個水平，正交試驗設計（L16（43））如表1所示。采用HPLC法測定大豆維生素E含量，3次重復。

1.4 液相色譜檢測方法的優化

參考GB/T 5009.82—2016 食品維生素E中測定維生素E的方法，對測定維生素E的各個高效液相色譜條件進行優化。

1.4.1 最佳流動相 分別在流動相為甲醇、甲醇∶水＝98∶2（體積比）、甲醇∶水＝96∶4（體積比），柱溫35℃，流速1 mL/min，波長294 nm條件下，經HPLC測定各對應峰面積。

1.4.2 最佳溫度 分別設定柱溫為25、30、35、40℃，流動相為甲醇，流速1 mL/min，波長294 nm條件下，經HPLC測定各自對應峰面積。

1.4.3 最佳流速 分別在流速為0.8、1.0、1.2mL/min，流動相為甲醇，柱溫35℃，波長294 nm條件下，經HPLC測定各對應峰面積。

表1 HPLC法測定維生素E正交試驗設計

1.4.4 最佳檢測波長 分別設置波長為290、294、295、300 nm，流動相為甲醇，柱溫35℃，流速1 mL/min條件下，經HPLC測定各對應峰面積。

1.5 標準曲線的確定

利用高效液相色譜法測定不同大豆品種各生育酚峰面積，經計算大致確定山西當地大豆品種各生育酚的濃度范圍。配制5個濃度梯度（囊括所得濃度范圍）的δ-生育酚、γ-生育酚、α-生育酚，測得峰面積，以濃度（X，μg/mL）對峰面積（Y）作圖，用Excel軟件進行回歸擬合，即得到α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚的標準曲線方程。各生育酚濃度梯度如表2所示。

表2 各生育酚濃度梯度 μg/mL

1.6 維生素E質量的計算

根據各生育酚標準曲線確定回歸方程，計算得到待測溶液中各生育酚的濃度（c），進一步計算得到樣品中各生育酚的質量（Xi）。

其中，Xi為樣品中大豆維生素E的含量（μg/g）；c為樣品中各生育酚濃度（μg/mL）；V為樣品總體積（mL）；m為樣品質量，樣品為脫水大豆粉（g）。

1.7 回收率及精密度的確定

將α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品分別稀釋到同一個低濃度下經HPLC測定其峰面積，重復6次。

取維生素E混合標準品溶液，按照色譜條件進行測定，連續進樣6次，每次進樣量為20 μL，記錄各生育酚單體峰面積，并計算各單體含量及相對標準偏差[25]。

相對標準偏差（RSD）＝標準偏差（SD）/計算結果的算術平均值（X）×100% （2）

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 單因素試驗 為了得到維生素E組分最佳提取條件，以抗壞血酸的加入量、提取液乙醇濃度、超聲波萃取時間為考慮因素，維生素E組分含量為評價指標，經單因素試驗分析，確定適合大豆維生素E組分提取的最佳條件。從圖1可以看出，其他條件不變情況下，加入抗壞血酸的量對提取維生素E的影響不大，當加入0.100 g抗壞血酸時，3種生育酚對應峰面積相對較大。

從圖2可以看出，在其他條件不變情況下，分別用50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇提取維生素E，3種生育酚對應峰面積整體呈現出先上升后下降的趨勢，于70%濃度乙醇提取下效果較佳。

從圖3可以看出，在其他條件不變情況下，超聲提取時間對3種生育酚含量波動不大，超聲提取20 min時，3種生育酚對應峰面積相對較大。

2.1.2 正交試驗 由圖4可知，處理15條件下，α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的峰面積均達到最大值，分別為10.2、104.0、57.9。說明該條件下各生育酚提取效率最高，因此，選擇加入0.125 g抗壞血酸、70%乙醇提取液、超聲提取20 min為最佳提取條件。

2.2 液相色譜檢測條件的優化

2.2.1 不同流動相比例對測定維生素E含量的影響 從圖5可以看出，不同流動相條件下各生育酚的峰形均呈現較好的分離狀態，且峰形尖銳。當流動相為純甲醇時，各生育酚出峰時間明顯提前于甲醇與水的混合流動相，綜合考慮成本、效率等因素，本試驗選擇純甲醇為定量分析大豆維生素E的流動相。

2.2.2 不同流速對測定維生素E含量的影響 從圖6可以看出，試驗比較了0.8、1.0、1.2 mL/min這3個流速下維生素E色譜峰的峰形及分離情況，綜合考慮分離度、峰形、出峰時間，最終確定流速為1.0 mL/min時，峰形及分離效果最佳，且基線穩定性較好，所以，本試驗選擇的流速為1.0 mL/min。

2.2.3 不同色譜柱溫度對測定維生素E含量的影響 從圖7可以看出，柱溫對各生育酚的峰面積及峰形影響不大，35℃時分離效果最好，且基線穩定性較好，所以，本試驗選擇色譜柱溫35℃。

2.2.4 不同檢測波長對測定維生素E含量的影響

根據文獻報道，維生素 E 在 290、294、295、300nm[26-28]處有最大吸收，本試驗同時對同一樣品在4個波長下進行檢測。由圖8可知，維生素E在295 nm處的吸收強于其他波長的吸收，因此，本試驗所選的檢測波長為295 nm。

2.3 各生育酚回歸方程和檢出限的分析

配制維生素E組分的一系列混合標準溶液，在確定的最佳色譜條件下進行分析。以3種生育酚濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，得到維生素E各組分的線性方程、決定系數及檢測限，結果如表3所示。

從表3可以看出，用該方法檢測的α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的線性方程的決定系數R2均大于 0.999 7，檢出限分別為 0.15、0.03、0.03 μg/g，呈現良好的線性關系。

表3 生育酚HPLC測定時濃度（X）與峰面積（Y）的關系

2.4 回收率和精密度分析

將α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品分別稀釋到一個低濃度下經HPLC測定其峰面積，重復6次。經計算得出，回收率的范圍為96.9%～101.2%，相對標準偏差均小于2，可用于維生素E各組分的定量分析（表4）。

表4 回收率和精密度測定結果

3 結論與討論

目前，高效液相色譜法廣泛用于定量分析不同樣品中的微量物質，如花青素[29-30]、熒光增白劑[31]、皂苷[32]等。有研究表明，長期服用維生素E可以增強人體的免疫功能，對細胞增殖有一定的作用[33]。因此，本試驗采用高效液相色譜法來測定大豆維生素E含量。

試驗結果表明，提取維生素E主要取決于提取液的濃度，加入的抗壞血酸的量和提取時間對提取維生素E的影響不大。最終確定的方法與李海燕[24]的方法相近，稱取0.100 0 g大豆粉，加入0.125 g抗壞血酸，70%乙醇提取液，超聲提取20min。雖然C18色譜柱是鍵合型的，填料很難被洗下來，但是萃取液正己烷是非極性溶劑，即使進樣量只有20 μL，若樣品量大，長期下來還是會對柱效產生較大影響，又因維生素E易氧化，因此，本試驗借鑒LU等[34]使用N2將正己烷吹干后復溶于洗脫液甲醇經HPLC測定。

本研究結果表明，最終確定的HPLC測定方法：流動相為甲醇，柱溫35℃，檢測波長295 nm，流速1.0 mL/min，這與柳樹海等[27]的方法基本一致，維生素E各組分標準曲線的R2值均大于0.999 7，維生素E各組分的回收率在96.9%～101.2%，測定結果的重現性和精密度良好，可以準確定量維生素E的含量，這與王麗等[35]研究生育酚異構體回收率的結果一致，因此，該方法可用于測定大豆籽粒中各生育酚含量。