高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析谷子葉片和莖稈中使它隆的殘留差異

劉亞楠，張麗光，郭浩璇，暢灼卓，王雅情，董淑琦，原向陽(yáng)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

使它隆又名氯氟吡氧乙酸，通用名為氟草煙和氟草定，是美國(guó)陶氏益農(nóng)研發(fā)的苗后選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，可用于防除小麥[1]、玉米[2]、谷子[3]等禾本科作物田的反枝莧、藜、苘麻等闊葉雜草[4-5]。除草劑在保護(hù)作物免受雜草危害、提高糧食產(chǎn)量的同時(shí)，也存在著農(nóng)藥殘留威脅人畜健康和環(huán)境安全的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）是一種簡(jiǎn)單、高效測(cè)量農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法[8]。劉松健等[9-10]利用HPLC-MS/MS法分別檢測(cè)了水稻和玉米植株中農(nóng)藥的殘留及其消減動(dòng)態(tài)；而高宗軍等[11]將玉米莖葉分離，采用LC-MS/MS法檢測(cè)玉米植株不同部位環(huán)丙沙星的殘留，結(jié)果表明，環(huán)丙沙星殘留量在玉米葉片中高于莖稈。而使它隆作為谷田安全的除草劑，在保證除草劑對(duì)作物安全的條件下，檢測(cè)其殘留至關(guān)重要。在檢測(cè)過(guò)程中，由于不同的作物，其葉片和莖稈的形態(tài)、占植株的比例、吸收傳導(dǎo)等差異，不同時(shí)間段后農(nóng)藥的殘留可能存在差異，影響檢測(cè)結(jié)果。

本試驗(yàn)研究了谷田施用化學(xué)除草劑使它隆后不同時(shí)間段在谷子葉片和莖稈中的殘留差異及變化規(guī)律，旨在為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的合理取樣提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試谷子品種為張雜谷10號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所提供。

1.2 試劑與儀器

使它隆（fluroxypyr）標(biāo)準(zhǔn)品（純度 99.7%），上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；20%使它隆乳油，美國(guó)陶氏益農(nóng)公司；乙腈，色譜純，美國(guó)honeywell公司生產(chǎn)；甲酸，色譜純，純度為92%，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂均為分析純，購(gòu)于天津致遠(yuǎn)公司；超純水，Heal Force超純水制備器。吸附劑：C18（粒徑 50 μm，Agela Technologies）、石墨化碳（GCB）（120-400mesh，Agela Technologies）。

安捷倫1290-6470超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS），安捷倫科技有限公司生產(chǎn)；ESI源；電子天平，上海精科生產(chǎn)；超聲波清洗器（PS-60A）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)，SIGMA）；渦旋儀（艾卡 VORTEX 2）；移液槍（德國(guó)，eppendorf）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年6—7月在太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省作物化學(xué)調(diào)控工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。采用盆栽試驗(yàn)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的谷子，于3～5葉期莖葉均勻噴施20%使它隆乳油，設(shè)推薦用量（1.05 L/hm2）和1.5倍推薦用量（1.58 L/hm2）等 2 個(gè)處理，對(duì)水量為 450 L/hm2，以噴施清水作為對(duì)照。分別于施藥后2 h、8 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、28 d 隨機(jī)取樣，每次剪取 10 株谷子，將莖稈和葉片分離，剪碎并分別混合均勻，準(zhǔn)確稱取1 g莖稈和1 g葉片，分別放入研缽中研磨至漿狀，置于15 mL離心管中，于-20℃保存，待測(cè)。

1.4 樣品前處理

分別取出提前勻漿處理的裝有1g樣品的15mL離心管（全莖稈或全葉片），加入1 mL超純水，渦旋0.5 min，依次加入0.5 g無(wú)水硫酸鎂、0.2 g氯化鈉和3 mL 2%甲酸的乙腈，劇烈振蕩搖勻，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，移取0.6 mL上清液至裝有凈化劑的3 mL離心管中（凈化劑：20 mgPSA＋10 mg GCB＋60 mg MgSO4），渦旋 1 min，4 000 r/min 離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待進(jìn)樣。

1.5 檢測(cè)條件

色譜條件為：Zorbax-Rrhd SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫 55℃；進(jìn)樣體積1 μL；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨水溶液，B相為乙腈；流速0.4 mL/min。梯度洗脫：0～6 min，10%A，90%B；＞6～8 min，10%A，90%B；＞8 min，80%A，20%B。在此條件下，使它隆標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為6.266 min。

質(zhì)譜條件：采用正負(fù)離子同時(shí)掃描，電噴霧離子源（ESI）；離子源接口電壓＋3 kV；霧化氣為氮?dú)猓魉贋?.4 mL/min；干燥氣為氮?dú)猓魉贋?5 L/min；碰撞氣為氬氣，壓力為230 kPa；脫溶劑管溫度200℃；加熱模塊溫度400℃。質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取使它隆標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用2%甲酸的乙腈定容至10 mL，配成1 mg/mL的使它隆標(biāo)品母液，于-20℃冰箱保存。準(zhǔn)確移取適量的標(biāo)準(zhǔn)母液，用2%甲酸的乙腈逐級(jí)稀釋配得 1、0.1、0.01、0.002 mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)5次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 添加回收試驗(yàn)

在谷子植株的莖稈和葉片的空白樣品中分別添加0.01、0.10、1.00 mg/kg 3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4、1.5方法提取、凈化及測(cè)定，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，計(jì)算平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、制圖及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及方法靈敏度

在0.002～1.0 mg/L范圍內(nèi)，使它隆的進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x軸）與色譜峰面積（y軸）呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，回歸方程為：y＝24 216x－149 790（R2＝0.999 8）。結(jié)果表明，使它隆的標(biāo)準(zhǔn)曲線精度高，線性好，可以用于樣品中使它隆的殘留檢測(cè)。

2.2 方法準(zhǔn)確度與精密度

表1 使它隆在谷子不同部位中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表 1 可知，在 0.01、0.10、1.00 mg/kg3 個(gè)添加水平下，使它隆在谷子葉片和莖稈中的平均添加回收率分別為82.5%～126.4%和87.4%～110.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～6.2%和4.8%～9.2%，且在使它隆出峰時(shí)間無(wú)明顯雜質(zhì)干擾，符合農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥分析與檢測(cè)要求。

2.3 不同時(shí)間內(nèi)使它隆在谷子葉片和莖稈中的殘留量

從表2可以看出，谷子苗期莖葉噴施推薦劑量和1.5倍推薦劑量的使它隆乳油，植株葉片和莖稈中的殘留量隨時(shí)間的推移呈下降的趨勢(shì)。施藥后2 h～3 d，使它隆主要存在于谷子植株的葉片中，顯著高于其莖稈中的殘留量8.9～14.9倍。施藥劑量為推薦劑量時(shí)，3 d內(nèi)各時(shí)間段內(nèi)葉片中的殘留量較2 h分別降低了44.96%、59.94%、66.03%、93.47%，莖稈中的殘留量較2 h分別降低了23.78%、39.72%、43.46%、56.29%。施藥劑量為1.5倍推薦劑量時(shí)，谷子葉片及莖稈各時(shí)間范圍內(nèi)殘留量的變化規(guī)律相似，3 d內(nèi)各時(shí)間段內(nèi)葉片中的殘留量較2 h分別降低了48.10%、65.19%、67.27%、93.18%，莖稈中的殘留量較2 h分別降低了34.61%、52.17%、55.46%、71.55%；藥后7 d，使它隆在谷子植株葉片和莖稈中的殘留量差異均不顯著，且均低于0.2 mg/kg（國(guó)家規(guī)定最大殘留限量）[12-13]。

表2 不同時(shí)間使它隆在谷子葉片和莖稈中的殘留量 mg/kg

3 結(jié)論

本研究表明，在谷子苗期莖葉噴施推薦劑量（1.05 L/hm2）的使它隆乳油，在2 h～3 d的時(shí)間內(nèi)，谷子葉片中使它隆的殘留量明顯高于莖稈中殘留量，分別是莖稈中殘留量的 14.9、10.7、9.9、8.9、2.2 倍；在之后的時(shí)間內(nèi)，谷子葉片和莖稈中殘留量差異不顯著。因此，在2 h～3 d時(shí)間段的樣品，植株前處理過(guò)程稱取樣品時(shí)，要注意將樣品混勻。