UV-B輻射對谷子葉色及米色形成的影響

郝瑞麗 ，王 喆 ，李 萌 ，張 彬 ，韓淵懷 ，申慧芳

（1.山西農業(yè)大學文理學院，山西太谷030801；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

自然界中紫外線按波長的長短分為長波紫外線（UV-A，320～400 nm）、中波紫外線（UV-B，280～320 nm）與短波紫外線（UV-C，200～280 nm）。研究表明，UV-A對植物影響極小，但UV-B對植物的光合作用、生理生化及抗氧化系統等方面均有較顯著影響[1-2]。20世紀以來，平流層臭氧層變薄，到達地表的UV-B輻射增強[3]。近年來，UV-B輻射增強對植物所造成的影響引起研究者們的關注，已在小麥、玉米、水稻以及大豆等作物上進行了大量研究，并取得了一定研究進展[4-6]。許多研究表明，UV-B輻射會干擾、抑制植物的光合作用（如光合色素含量降低、光合速率降低以及光合作用過程中關鍵酶受抑制等）[7-8]，導致植物光合能力下降，最終對植物的生長、發(fā)育和繁殖過程產生負面影響。且有研究發(fā)現，UV-B輻射能夠通過激發(fā)植物自身機體的抗氧化系統來提高抗氧化能力[9]，如 SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性增強。谷子是我國北方重要的雜糧作物，但有關UV-B強度對谷子光合等生理指標及米色的研究報道還較少，因此，研究谷子對UV-B輻射增強產生的生理響應具有重大理論與現實意義。

谷子（Setaria italica（L.）Beauv.），屬禾本科狗尾草屬，古代稱禾，又名粟，經脫殼處理后稱小米[10-11]，具有生育期短、耐旱及貧瘠土壤、適播時間長、耐儲藏等優(yōu)勢，在我國旱作農業(yè)中具有深遠的影響[12-13]。隨著社會的不斷發(fā)展，人們生活水平不斷提高，對各種食物的要求也逐漸提升。對于小米而言，米色能夠直觀反映小米品質的優(yōu)劣[14]，是谷子品質評價中的重要指標。有研究表明，小米顏色不同的谷子品種其營養(yǎng)品質也具有明顯差異，小米顏色與其蒸煮后米飯、米湯的色澤、香味及適口性等呈極顯著正相關，小米顏色越黃，米飯、米湯的色澤、香味及適口性越好[15-16]。同時還發(fā)現，小米中黃色素含量與其外觀品質也呈顯著正相關，而類胡蘿卜素是黃色素的主要成分，因此，小米顏色與類胡蘿卜素的積累具有一定相關性[17]。

類胡蘿卜素是一類由異戊二稀組成的萜類化合物大家族，常于高等植物的花與果實色素母細胞中積累，使其呈現黃色、橙色或紅色，且其結構超過600多種，常見的為β-胡蘿卜素和茄紅素。類胡蘿卜素不僅是植物光合作用中的保護劑，而且具有食療、保健功能，如具抗癌功能、降低血管發(fā)病率等。隨著谷子營養(yǎng)及保健功能的研究與開發(fā)，食用小米需求量日益增大，進一步開發(fā)利用天然類胡蘿卜素資源已成為一個發(fā)展趨勢。

植物能夠通過自身生理生化過程來自我調節(jié)而適應UV-B輻射脅迫。本研究通過對不同強度UV-B輻射處理下不同品種谷子幼苗葉片光合色素、抗氧化酶等生理生化指標以及米色等的測定與分析，旨在探究UV-B輻射脅迫下谷子幼苗的抗逆生理生化相應抗性模式，為谷子抵御UV-B輻射機制的研究以及今后培育富含類胡蘿卜素的優(yōu)良谷子品種奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試谷子材料為噸谷和沁黃2號，由山西農業(yè)大學雜糧分子育種團隊提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試材料的種植及UV-B輻射處理 將供試材料的種子于2019年5月上旬經自來水4℃浸泡36 h后，播種于山西農業(yè)大學農學院掛藏樓溫室氣候室進行幼苗培育，待其長至七葉期進行紫外燈管照射及遮膜處理來模擬UV-B輻射的增強與減弱，設置為UV-B＋與UV-B-處理組，以自然光處理為對照組，分別處理10、20、30 d后進行旗葉的采集用于各指標的測定。所用紫外燈管（波長范圍290～400 nm，峰值310 nm）購自北京光電源研究所，UV-B強度平均為223.8 μW/cm2，每天照射時間為 9：00—17：00；UV-B- 處理組加遮 KS-60 隔紫外線膜處理后其UV-B強度平均為4.24 μW/cm2；對照組UV-B強度為95.43 μW/cm2。測量UV-B強度所用的紫外輻照計（UV-297 nm），為北京師范大學光電儀器廠生產[18]。

同時將浸泡種子播種于山西農業(yè)大學試驗田，采取隨機區(qū)組設計，設置3個生物重復進行材料種植，待抽穗期對植株進行遮KS-60隔紫外線膜處理，設為UV-B-輻射處理組，UV-B強度均值為43.9 μW/cm2，自然光照為對照組，其UV-B強度133.18 μW/cm2，直至籽粒成熟收獲。

1.2.2 葉片光合色素含量測定 分別對噸谷、沁黃2號2個品種谷子處理10、20、30 d的倒二葉進行葉綠素、類胡蘿卜素含量測定和分析。紫外處理至10、20、30 d時，2個谷子品種分別取3株，每株取旗葉中部，去中脈、剪碎并混勻。稱取3份，每份0.2 g，作為3個生物重復；用液氮研磨成粉末置于10 mL離心管中，分別加入6 mL丙酮和乙醇（2∶1，V/V）混合溶液進行提取，室溫避光條件下在振蕩器中振蕩24～48 h，直至組織變白，12 000 g離心10 min，以乙醇和丙酮混合液為參比，測定其645、633 nm處吸光值，每個品種重復3次。計算方法參照文獻[19]進行。

式中，Chl a、Chl b、Chl分別為葉綠素 a、葉綠素b、葉綠素總量，單位均為mg/g；V為提取液體積；W為樣品質量；A645、A663分別為波長645、663 nm下的吸光值。

1.2.3 酶活性等指標的測定 采用氮藍四唑光還原法測定SOD活性；用愈創(chuàng)木酚法對POD活性進行分析[20]；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法[21]；CAT活性測定參照文獻[22]進行。

1.2.4 米色的測定 使用非接觸式色差儀（X-Rite VS450 colorimeter）對米色進行測定與分析，采用CIE L*a*b*色度系統，測定指標L*代表亮度，a*代表紅色/綠色度（正值代表紅色，負值代表綠色），b*值代表黃色/藍色度（正值代表黃色，負值代表藍色）[23]。每個樣品進行3次重復，取平均值。

1.2.5 籽粒總類胡蘿卜素提取及含量測定 將色差測定后的小米參照AACC法[24]，用水飽和正丁醇在避光條件下對其進行總類胡蘿卜素提取。將所挑選的小米用研磨機充分研磨獲得小米粉，過0.149mm篩以保證米粉粗細均勻，稱取0.6g于10mL離心管，分別加入6mL水飽和正丁醇，充分混勻，置于HY-4型調速多用振蕩器上室溫振蕩3 h，8 000 r/min 4℃下離心15 min，收集上清液。以水飽和正丁醇作參比，使用紫外可見分光光度計測定A450，每個樣品進行3次生物學重復。

式中，A450為450 nm處吸光值；0.250為轉換系數；V為提取液體積；m為樣品質量。

1.2.6 類胡蘿卜素成分及其含量測定 使用高效液相色譜法（HPLC）測定籽粒中類胡蘿卜素成分與含量。色譜條件：色譜柱為C30柱；流動相A為甲醇∶MTBE∶水＝81∶15∶4（體積比）；流動相B為MTBE∶甲醇＝90∶10（體積比）；檢測波長為450nm；溫度為35℃；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；采用梯度洗脫，分別設0～20 min，流動相B 0～22.2%；20～25 min，流動相 B22.2%～0；25～30 min，流動相B0。

標準曲線繪制：將1 mg葉黃素和玉米黃質標準品分別用水飽和正丁醇稀釋為：葉黃素48、4.8、0.96 μg/mL；玉米黃質 15、7.5、1.5 μg/mL。以進樣量（μg/mL）為橫坐標 X，峰面積（mAU·min）為縱坐標Y，進行線性回歸分析，得出線性回歸方程：葉黃素為Y＝2.270 7X（R2＝0.999 1）；玉米黃質為Y＝2.578 5X（R2＝0.999 32）。葉黃素與玉米黃質均在0.034～50 μg/mL范圍內線性關系較好，檢測限分別為0.013、0.016 μg/mL。進樣前須將總類胡蘿卜素提取液用0.45 μm過濾器進行過濾，將濾液裝于液相色譜棕色試樣瓶待用，在上述色譜條件下進行上機測定，每樣品進行3次生物學重復，取平均值。

1.3 數據處理

使用Excel對試驗所測數據進行統計整理、數據處理以及繪圖分析，并使用IBMSPSSStatistics 20軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 UV-B輻射處理對谷子幼苗葉片光合色素含量的影響

由圖1可知，隨時間的推移，噸谷UV-B＋處理組類胡蘿卜素含量呈現先上升，20 d后持續(xù)下降趨勢，UV-B－處理組始終處于下降趨勢，30 d后二者均顯著低于對照組，葉綠素含量變化趨勢同類胡蘿卜素含量相似，2個處理組均顯著低于對照組。沁黃2號UV-B－處理組類胡蘿卜素及葉綠素含量開始均略微上升，20 d后均呈持續(xù)下降趨勢，UV-B＋處理組2個色素含量開始均緩慢下降，20 d后迅速下降，30 d后均顯著低于對照組。

2.2 UV-B輻射處理對谷子幼苗葉片保護酶活性的影響

分別對不同處理下谷子葉片進行酶液的提取，對其SOD、POD、MDA、CAT進行測定，探究其不同UV-B條件下對葉片保護酶活性的影響。由圖2可知，與對照組相比，噸谷與沁黃2號UV-B＋處理組谷子苗期SOD、POD活性均隨時間增加逐漸升高，說明UV-B輻射增強可以提高谷子幼苗的抗氧化防護酶活性；而UV-B-處理組SOD活性呈先升高后逐漸下降，30 d時低于處理組；對于POD，UV-B-處理組呈先下降，20 d后逐漸上升的趨勢。

植物遭受外界逆境脅迫時，細胞膜結構和功能會最先受到傷害，MDA含量高低是抗逆生理中衡量植物細胞膜受傷害程度的重要指標之一。由圖2可知，UV-B＋與UV-B-處理組隨著處理時間的增加，MDA含量都呈升高趨勢，但是30 d時，噸谷2個處理組均顯著低于對照組，而沁黃2號2個處理組高于對照組，說明UV-B輻射對沁黃2號葉片細胞膜結構的脅迫程度要高于噸谷。MDA含量對UV-B輻射處理下谷子幼苗葉片的細胞質膜結構具有一定保護作用。

對于CAT，噸谷與沁黃2號UV-B＋和UV-B-處理組呈現相似趨勢，隨著處理時間的增加，均呈現先降低后升高的趨勢，30 d時噸谷UV-B＋處理組低于對照組，UV-B-處理組逐漸高于對照組，而沁黃2號UV-B＋與UV-B-處理組始終高于對照組。

2.3 UV-B輻射處理對米色的影響

用色差儀（X-Rite VS450 colorimeter）對米色 L*、a*、b*這3個指標進行測定，結果如圖3所示。由圖3可知，噸谷與沁黃2號在UV-B-處理下L*、a*、b*值變化具有一致性，噸谷UV-B-處理組L*、a*、b*值均低于對照組，分別為L*值降低了9.7%，a*值降低了2.9%，b*值降低了3.3%；沁黃2號UV-B-處理組 L*、a*、b*值降低程度更大，L*值降低 72.6%，a*值降低22.2%，b*值降低23.9%。

2.4 UV-B輻射處理對籽粒總類胡蘿卜素含量的影響

由圖4可知，在UV-B強度降低條件下，噸谷的小米總類胡蘿卜素含量降低，UV-B-處理組較對照組降低了8.97%，沁黃2號的小米總類胡蘿卜素含量比對照組降低了2.8%。

2.5 UV-B輻射處理對葉黃素和玉米黃質含量的影響

小米呈黃色主要原因是存在有黃色素，而類胡蘿卜素為黃色素的主要成分，通過HPLC分離小米中類胡蘿卜素組分，比較葉黃素和玉米黃質2個組分的含量變化，進而明確不同UV-B強度下小米總類胡蘿卜素組分的含量變化及差異。

由圖5可知，葉黃素保留時間約為10 min，而玉米黃質約為11 min。通過對照小米總類胡蘿卜素提取液的色譜圖，可將其中葉黃素與玉米黃質分離，當出現峰與標準品保留時間一致時，即為標準品對應的組分。

根據葉黃素和玉米黃質線性回歸方程求得葉黃素和玉米黃質含量，如圖6所示。

從圖6可以看出，噸谷與沁黃2號2類胡蘿卜素組分變化具有一致性，與類胡蘿卜素含量變化相符。噸谷UV-B-處理組葉黃素含量較對照組降低14.5%，玉米黃質含量降低13.0%；沁黃2號UV-B-處理組葉黃素含量較對照組降低9.4%，玉米黃質含量降低7.7%。

3 結論與討論

3.1 不同UV-B強度對葉片光合色素含量的影響

葉綠素位于類囊體膜上，是主要的光合色素。研究表明，當植物處于UV-B輻射條件下，體內光合色素的含量會下降[25]。王小菁等[26]研究發(fā)現，UV-B增加對葉綠素、類胡蘿卜素含量有著明顯的影響，UV-B可引起大豆、黃瓜等植物葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的下降。SINGH等[27]對豌豆進行UV-B處理，研究表明，體內類胡蘿卜素含量出現急劇下降。馮虎元等[28]研究表明，UV-B輻射劑量增強，導致多數大豆品種光合色素（葉綠素a、葉綠素b）含量減少，類胡蘿卜素含量降低。本研究中，UV-B＋處理組類胡蘿卜素與葉綠素含量在20 d前均呈現略微上升趨勢，說明在UV-B一定處理范圍內有利于色素的積累，也可能是谷子試圖適應該時期UV-B輻射的一種生理生化反應；而20 d后隨著輻射量的累積及光合作用影響時間的延長，色素含量均呈下降趨勢，這一結果與多數報道相同，UV-B輻射抑制了葉綠素的含量，原因可能是加速了葉綠素的分解或抑制了葉綠素的合成，從而導致葉片葉綠素含量降低[3]；而UV-B-處理下色素含量下降，可能是在降低UV-B強度條件下影響了光合作用的進行，使色素積累下降。總體而言，UV-B＋及UV-B-條件下葉片色素積累均下降，說明了UV-B過高與過低都不利于植株光合作用的進行及色素積累。

3.2 不同UV-B強度對抗氧化保護酶的影響

作物自身機體內的抗氧化系統在UV-B輻射增強條件下會被激發(fā)，其抗氧化能力提高。杜照奎[29]研究發(fā)現，在大田中將花生植株置于UV-B輻射強度為 54 μW/cm2條件下處理 2 d（每天 8 h），葉片中SOD、CAT和POD等組成酶類抗氧化系統的酶活性均顯著增強。MAHDAVIAN等[30]研究發(fā)現，用UV-B對辣椒進行輻射處理，其體內許多酶如POD、PPO、CAT以及GR的活性都得到大幅提升。本研究中，UV-B＋處理組SOD、POD活性隨著處理時間的增加而升高，與前人的研究結論基本一致，表明在UV-B輻射增強條件下谷子機體內抗氧化酶SOD、POD活性增強，以此適應UV-B對其產生的外界抗逆反應；而UV-B-處理下其SOD、POD活性變化呈相反狀態(tài)，仍有待研究。本研究中，2個UV-B處理條件下CAT活性均略微下降，20 d后逐漸上升，可能20 d前UV-B脅迫強度不夠，而在20 d后隨著脅迫強度的增加，激發(fā)了自身的抗氧化能力，CAT活性逐漸升高。研究發(fā)現，UV-B輻射能夠誘導產生氧自由基O2-、H2O2等，使得防御系統失衡而導致膜脂質過氧化，最終MDA積累增加[31-32]。本研究中，2個谷子品種在UV-B＋和UV-B-處理下MDA含量均呈持續(xù)上升趨勢，與前人結論相一致。

3.3 不同UV-B強度對小米總類胡蘿卜素及其成分與含量的影響

UV-B輻射通過影響植物生理、生化代謝反應進而對植物的生長與發(fā)育產生影響[33]。不同UV-B輻射強度對植物品質的影響有一定差異，南非醉茄在溫室環(huán)境下增加UV-B輻射強度，其體內類胡蘿卜素、花青素、番茄紅素及類黃酮等含量普遍增加[34]。張文會等[3]研究表明，UV-B處理導致大豆植株類胡蘿卜素含量增加。本研究中，噸谷UV-B-處理組較對照組類胡蘿卜素含量降低8.97%，沁黃2號UV-B-處理組較對照組降低2.8%；在類胡蘿卜素成分及含量測定中，噸谷UV-B-處理組葉黃素含量較對照組降低14.5%，玉米黃質含量降低13.0%；沁黃2號UV-B-處理組葉黃素含量較對照組降低9.4%，玉米黃質含量降低7.7%，這與前人研究結果相一致，表明在UV-B降低條件下，光合作用受到抑制，不利于色素的累積，導致小米中類胡蘿卜素含量降低。