NF-κB家族亞基在不同品種綿羊背部皮膚中基因水平表達差異的分析

吳佳豪，董亞潔，張嬌嬌，陸 娜，薛霖莉，曹校瑞，張鵬翔，赫曉燕

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

隨著人們生活水平的提高，毛紡織業的需求量日益增加，而羊毛的產量與質量直接影響著毛紡織業的發展。羊毛的質量指標主要有彎曲度、細度、密度、長度等，其中，彎曲度是其重要的生產性狀之一，對加工過程中羊毛斷裂損耗及毛紡品的柔軟度具有重要的影響。美利奴羊引自國外，毛被質量均勻且密度大，毛發細長彎曲數多，是毛紡織品的優良原料；小尾寒羊是我國肉裘兼用型綿羊品種，毛較粗直呈波形或平展無彎，雖長度、細度和彎曲度都不及美利奴羊毛，但因其數量大、種類多，而成為毛紡織工業的主要原料，其紡織品質量較美利奴羊毛紡織品差。因此，若能改善小尾寒羊毛發彎曲性狀，將對毛紡織工業具有重要意義[1]。

皮膚是機體重要的屏障和保護器官，毛囊是皮膚重要而復雜的附屬結構，而毛發作為毛囊細胞增殖和分化的產物，是皮膚的衍生物[2]。因此，欲改善綿羊毛發彎曲性狀，首先要了解毛發彎曲的分子調控機制，同時研究毛囊的發育生物學。近年來，有關毛發生長及發育的研究已有一定進展，但有關羊毛彎曲性狀形成的分子機制研究并不多見，以至于影響羊毛彎曲性狀形成的機制仍然沒有系統的概述[3]。近20 a來，對小鼠、人等哺乳動物毛發纖維彎曲形成調控機制進行的研究雖已有了很大進展，但由于同源性的差異，羊毛彎曲性狀形成的調控機制仍有待進一步探究。盡管不同種動物毛發的長度、細度、彎曲度等特性差異明顯，且形成這些差異的分子機制尚不十分明確，但因毛囊發生、發育和毛發生長的分子調控機制被發現在許多哺乳動物中是相似的，這便為進一步探究羊毛彎曲形成的分子機制提供了一定的理論基礎[3-4]。

目前，已發現多個參與毛發生長發育和毛囊形態發生所需的信號通路，如Wnt和EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路等[5-8]。這些信號通路中的配體、受體、信號分子和轉錄因子及其靶基因的遺傳突變、表觀遺傳修飾和蛋白質翻譯后修飾的改變等都會影響動物毛囊發育，造成毛發生長和品質方面的變化[8-12]。同時，眾多文獻表明，NF-κB與EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路關系密切，而EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路對于毛發彎曲性狀的形成具有重要影響，因此，NF-κB存在對羊毛彎曲調控的可能性[13-17]。

NF-κB是SEN等于1986年首次在成熟B細胞、漿細胞中發現的一類具有多向轉錄調節重要作用的核蛋白因子，因其能與B細胞免疫球蛋白親鏈基因的增強子（κB序列）特異性結合而得名。隨后研究了解到，NF-κB廣泛存在于組織細胞中，成分并不單一，由5種相關的轉錄因子構成，是一個大家族，它們分別是：NFκB1、NFκB2、RELA、RELB 和REL[18-21]。

本試驗選取美利奴羊和晉中綿羊（屬小尾寒羊）2個不同品種的綿羊作為研究對象，利用實時熒光定量PCR方法對不同品種綿羊背部皮膚中NF-κB各亞基的表達水平進行檢測，旨在了解NF-κB家族各亞基基因水平的表達差異，分析在不同品種綿羊背部皮膚中與形成毛發性狀差異相關的關鍵性基因，旨在為了解毛發性狀形成相關分子調控機制提供途徑，為進一步改善晉中綿羊毛發彎曲性狀、促進毛紡織工業發展提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及取材

選取山西省介休種羊場以相同條件飼喂的健康雌性3歲齡白色美利奴羊和晉中綿羊各4只。剃除各自背部相同部位的毛發后，利用取皮器進行皮膚樣品采集，經生理鹽水清洗處理后，置于液氮中保存，用于后續試驗。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolReagent（Invitrogen公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司）；SYBR PremixExTaqTMⅡ（TaKaRa公司）。

微量移液槍（Eppendorf公司）；超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；ND-1000微量核酸蛋白測定儀（NanoDrop Technologies公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；梯度PCR儀（Eppendorf公司）；MultilageTMLight Cabinet Filter Positions（Alpha Innotech 公司）；Mx3005PTMMultiplex Quantitative PCR System（STRATAGENE公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計與合成 以綿羊的18S rRNA作為內參基因。根據NCBI中登錄的羊屬NFκB1（登錄號：XM_027970852.1）、NFκB2（登錄號：XM_027960 471.1）、RELA（登錄號：XM_027959295.1）、RELB（登錄號：XM_015100238.2）、REL（登錄號：XM_027966 801.1）與 18S rRNA（登錄號：XR_003587981.1）CDS區的序列，利用Primer Premier 5.0設計特異性引物，引物信息如表1所示。引物均由華大公司合成。

表1 引物序列信息

1.3.2 提取總RNA 取液氮凍存的取材組織，按照Trizol試劑盒說明書分別提取美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚組織樣品中的總RNA；提取的總RNA使用ND-1000微量核酸蛋白測定儀，測定其純度及濃度，并利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織總RNA的完整性。

1.3.3 反轉錄合成cDNA 以檢驗合格的組織總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser（參照其說明書）反轉錄得到2種綿羊樣本的cDNA模板，并調整濃度為100 ng/μL，置于-20℃保存備用。

1.3.4 實時熒光定量PCR 以1.3.3反轉錄得到的2種綿羊樣本背部皮膚組織的cDNA為模板，以18SrRNA為內參基因，使用SYBRPremixExTaqTMⅡ（參照其說明書）進行實時熒光定量PCR擴增，每個樣本進行4次有效重復。PCR反應體系為：cDNA1μL，SYBR PremixExTaqTMⅡ（2×）5 μL，ROXReference Dye 0.2 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各 0.4 μL，ddH2O3.0μL。PCR反應條件為：95℃預變性10min；95 ℃變性 30 s，退火 30 s（表 1），72 ℃延伸 20 s，40個循環；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s。熒光信號值在退火時收集。

1.4 數據分析

實時熒光定量擴增所得Ct值，結果利用2-ΔΔCt法計算NF-κB家族各亞基在美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚中mRNA的相對表達量；利用GraphPad Prism 5.0統計分析軟件對數據進行差異顯著性分析，其中，ns表示P＞0.05差異不顯著，*表示P＜0.05差異顯著，***表示P＜0.001差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 2種綿羊背部皮膚組織樣本總RNA的提取

為探究NF-κB家族各亞基在美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚中基因水平的表達差異，提取美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚組織樣本的總RNA，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果均可見5S、18S和28S這3條帶，證明提取的各樣本總RNA中基因組和蛋白質污染去除干凈。同時經ND-1000微量核酸蛋白測定儀測定可知，所有樣本總RNA的A260/A280值均在1.8～2.0。證明提取的各樣本總RNA質量較好，符合后續反轉錄和定量分析試驗的要求。

2.2 NF-κB家族單個亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中的定量表達

通過實時熒光定量PCR試驗，以18S rRNA作為內參基因測定了目的基因在美利奴羊與晉中綿羊背部皮膚中的相對表達量，結果如圖1～5所示，利用 2-ΔΔCt法計算得出，NFκB1 mRNA 在美利奴羊背部皮膚中的相對表達量是晉中綿羊的1.897倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達量是晉中綿羊的2.025倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；RELA mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達量是晉中綿羊的0.619倍，且差異達顯著水平（P＜0.05）；RELB mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達量是晉中綿羊的1.791倍，但差異不顯著（P＞0.05）；REL mRNA在美利奴羊背部皮膚中的相對表達量是晉中綿羊的1.819倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）。NF-κB各亞基mRNA在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中的相對表達量均有差異，除RELA外其余各亞基mRNA的相對表達量在美利奴羊皮膚中均高于晉中綿羊。

2.3 美利奴羊背部皮膚中NF-κB家族各亞基的定量表達

在美利奴羊背部皮膚樣本中，NF-κB家族各亞基mRNA表達情況如圖6所示，RELB mRNA相對表達量最低，NFκB1 mRNA相對表達量是RELB mRNA的83.631倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA 相對表達量是 RELB mRNA的132.871倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；RELA mRNA相對表達量是RELB mRNA的94.085倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；RELB mRNA相對表達量是RELB mRNA的26.129倍，且差異達顯著水平（P＜0.05）。

2.4 晉中綿羊背部皮膚中NF-κB家族各亞基的定量表達

在晉中綿羊背部皮膚樣本中，NF-κB家族亞基mRNA表達情況如圖7所示，RELBmRNA相對表達量最低，NFκB1 mRNA相對表達量是RELB mRNA的78.960倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA相對表達量是 RELB mRNA的117.527倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；RELA mRNA相對表達量是RELB mRNA的272.238倍，且差異達極顯著水平（P＜0.001）；REL mRNA相對表達量是RELB mRNA的25.732倍，但差異不顯著（P＞0.05）。

3 結論與討論

羊毛是由皮膚內的毛囊發育而來的，毛囊在皮膚上成群分布，其生長是一個非常復雜的生理生化過程，主要包括毛乳頭可增殖細胞旺盛的分裂、分化、角質化和遷移等過程。經過毛囊周期過程中生長期、退行期和休止期的不斷更替，毛球與毛乳頭間的營養聯系不斷變化，毛球細胞增殖過程受其影響，毛根形態因此而發生改變，毛纖維在毛鞘內的狀態也隨之產生變化，從而使羊毛發生性狀方面的改變，如粗細、長短和彎曲程度方面的改變等[17]。因此，綿羊毛發性狀取決于其皮膚內毛囊的結構和特性[2]。

毛囊的生長發育狀況非常復雜，受遺傳、環境、營養等多方面的影響，不同品種動物毛囊的結構特性差異明顯，因而不同物種所表現出的毛發性狀也各不相同。越來越多的研究表明，不論是遺傳、環境還是飼養條件的差異，所造成的影響都會通過體內分泌產生的一些相關細胞因子作為中介來實現其想要產生的結果[4]，即毛囊結構和特性的差異實際是受細胞因子表達水平的強烈制約和影響的。作為體內分泌協調基因和環境的重要因子，細胞因子及其受體構成了調控毛囊形成發育和毛囊周期性生長的復雜網絡，繼而對羊毛生長的調控起著極其重要的作用[3，22]。因此，毛發性狀差異可能就是細胞因子表達水平差異的結果[23]。

本研究通過實時熒光定量PCR試驗發現，NF-κB家族各亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中基因水平的相對表達量存在差異。其中，NFκB1、NFκB2、RELB、REL 這 4 個亞基 mRNA 在美利奴羊的相對表達量均高于晉中綿羊，且分別是后者的 1.897倍（P＜0.001）、2.025倍（P＜0.001）、1.791倍（P＞0.05）、1.819倍（P＜0.001），表現出與性狀差異的正相關性，表明美利奴羊良好的彎曲性狀可能受到四者或四者之中某個亞基或某2個、某3個的正調控作用。與其他4個亞基形成鮮明對比的是RELA亞基mRNA在美利奴羊的相對表達量僅為晉中綿羊的0.619倍（P＜0.05），表現出與性狀差異的負相關性，表明美利奴羊的彎曲性狀可能受到其負調控作用。有研究表明，當毛乳頭中角質形成細胞分裂、遷移速率加快并引發角質化過程時，毛發纖維是直的；當細胞分裂、遷移速率過慢使角質化速率降低時，角質化可能發生在真皮乳頭，此時毛發纖維呈卷曲狀[14，24]。RELA對于細胞的分裂、分化和凋亡起著重要的調控作用，細胞的分裂水平和能力與RELA表達水平呈明顯的正相關[25]。本試驗表明，可能由于美利奴羊RELA mRNA的相對表達水平顯著低于晉中綿羊，從而使得形成毛纖維的角質形成細胞分裂能力較晉中綿羊更低，因此使得毛發的彎曲性狀比晉中綿羊更顯著。

單一物種方面，美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中RELB、REL的相對表達量都很低，這與文獻中RELB主要見于胸腺、脾臟、淋巴結等免疫器官中參與炎癥反應和免疫反應，而REL多見于造血細胞中的表述相符[19-20]。美利奴羊中，NFκB2 mRNA的相對表達量最高，RELA mRNA次之，表明NFκB2可能對于其毛發性狀的形成影響更為直接；而晉中綿羊中，RELA mRNA的相對表達量最高，NFκB2 mRNA次之，表明RELA對于其毛發性狀的形成影響可能更大。結合各亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中基因水平的相對表達量結果推測，NFκB2與RELA適當的相對表達水平對于毛發的彎曲性狀可能具有重要的調控作用。

EDA-A1/EDAR/EDARadd信號通路的激活是一復雜的生理過程，即EDA-A1與其受體EDAR結合進而激活胞內受體EDARadd，然后釋放出大量游離的NF-κB，NF-κB入核并調控核內靶基因的轉錄，從而調節多種生理活動[5，10]。同時，眾多文獻表明，該家族成員以一定的形式兩兩結合，形成不同的NF-κB轉錄因子，這些轉錄因子與核DNA特異性結合的位點不同，有的促進基因轉錄，有的則抑制基因轉錄[20-22]。若要進一步了解NF-κB對于毛發性狀形成的相關分子調控機制，則需做進一步的探索和研究。

本試驗表明，NF-κB 家族的 NFκB1、NFκB2、RELA、RELB和REL各亞基在美利奴羊和晉中綿羊背部皮膚中基因水平的相對表達量均有差異，其中，美利奴羊皮膚中NFκB2mRNA相對表達量最高，RELA mRNA次之；而晉中綿羊皮膚中，RELAmRNA相對表達量最高，NFκB2 mRNA次之。揭示NFκB2可能對于羊毛彎曲性狀的形成具有促進作用，RELA可能對于羊毛彎曲性狀的形成具有抑制作用，并且NFκB2與RELA適當的相對表達水平可能對于毛發彎曲性狀的形成起重要的調控作用。