清水江鯉性腺的早期發育及Foxl2基因功能初步分析

曾 圣， 劉 偉， 杜 強， 王艷艷， 周 洲， 胡世然

(1.貴州省農業科學院 水產研究所， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產工程技術中心, 貴州 貴陽 550025； 3.黔東南州農業科學院 水產研究所， 貴州 凱里 556000)

鯉(Cyprinuscarpio)屬硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯉屬，在我國除西部高原外，各地淡水中均有分布，是養殖歷史悠久(2 400余年)的重要養殖魚類。我國幅員遼闊、水資源豐富，有多個地方鯉魚種群，如黃河鯉、鏡鯉、興國紅鯉等，因而我國是巨大的鯉魚種質資源庫。近年來，通過雜交育種形成的福瑞鯉、松浦鏡鯉等高產優質新品種取得了巨大的經濟效益和社會效益[1-3]。

清水江鯉是貴州省黔東南州、黔南州等地稻田主要養殖的魚類品種，具有較高的經濟價值。由于梯級電站開發、增殖放流及人工養殖新品種的引入，野生清水江鯉的數量日趨減少，其種質資源遺傳多樣性也受到了一定程度的破壞。

目前，對清水江鯉的研究相對較少，董在杰等[4]通過微衛星標記和形態指標對清水江鯉的種質資源現狀的研究結果表明，清水江鯉群體表現出較高的遺傳多樣性水平，且群體內存在顯著遺傳分化。周洲等[5]通過測定清水江鯉8個形態學指標，研究清水江鯉外部形態性狀對體質量的影響表明，體長、體高、體厚、尾柄高、尾柄長是影響清水江鯉體質量的主要性狀。胡世然等[6]研究了清水江鯉在池塘養殖條件下的適應溫度范圍、最適攝食生長溫度、溶氧需求及pH適應范圍等的結果表明，野生清水江鯉可經人工馴化為淡水名優養殖魚類。胡世然等[7]將清水江鯉與江西興國紅鯉進行雜交改良，清水江鯉雜交改良子一代稻田飼養增產效果顯著。

人工選育是開發和保護清水江鯉種質資源的重要手段之一，為了解清水江鯉早期性腺發育及性腺發育過程中相關基因的表達，通過組織學切片觀察不同時期清水江鯉性腺，并通過RACE及RT-PCR克隆清水江鯉Foxl2基因，并分析Foxl2的功能，以期為清水江鯉的人工選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

清水江鯉苗種及成魚由凱里市福瑞水產養殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 性腺樣品采集及觀察 選取孵化后50 d、70 d、90 d、120 d、150 d和240 d清水江鯉性腺進行組織學切片觀察，以了解清水江鯉的性腺發育情況。清水江鯉性腺用波恩氏液固定過夜，70%酒精洗滌后，參照劉凱等[8]方法采用常規乙醇梯度脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，運用浙江科迪KD2508輪轉式切片機進行連續切片，切片厚度為6 μm，H.E染色，中性樹膠封片，NIKON E50i顯微鏡下觀察并拍照，應用Photoshop CS 6.0編輯圖片。

1.2.2 免疫組化 為觀察清水鯉早期生殖細胞分化情況，運用上述孵化后50 d及90 d切片進行免疫組化染色，抗體選用Vasa兔多克隆抗體(生殖細胞特異性抗體)。免疫組化主要參考DONG等[9]的方法。用0.01 M PBS洗滌3次，每次洗滌10 min后，將切片浸入含有0.1%吐溫20的0.01 M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中煮5 min。用Vasa兔多克隆抗體(1∶1 000)在4℃下孵育過夜，用0.01 M PBS沖洗3次，每次沖洗5 min。隨后，將組織切片與二抗(羊抗兔IgG)和辣根過氧化物酶以1∶2 000比例孵育30 min，然后用PBS沖洗3次，每次沖洗5 min。以二氨基聯苯胺為底物，觀察免疫反應信號。切片用蘇木精復染。

1.2.3Foxl2基因序列獲取 通過對項目組前期開展的清水江鯉成魚雌雄性腺轉錄組測序數據(未發表)進行分析，獲取清水江鯉Foxl2基因中間序列，并通過5′-和3′-RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)及與鯉魚基因組序列比對獲取Foxl2基因全序列。

1.2.4 系統發生 進化樹包括人類(NP_075555.1)、小鼠(NP_036150.1)、雞(AEE80502.1)、斑胸草雀(XP_002187454.1)、非洲爪蛙(BAH22852.1)、施氏鱘(BAZ96608.1)、許氏平鲉(AEX58659.1)、牙鲆(BAF69017.1)、青鳉(NP_001098358.1)、尼羅羅非魚(NP_001266707.1)、紅鰭東方魨(XP_003968794.2)、半滑舌鰨(NP_001281128.1)、金錢魚(AGH32772.1)、尖吻鱸(XP_018539633)、斑馬魚(NP_001038717.1，NP_001304690.1)、稀有鮈鯽(ADN38241.1)、大口鲇(ABK76309.1)、斑點叉尾鮰(XP_017350481.1)、金魚(XP_026092361.1、XP_026055792.1和XP_026138658.1)、七彩神仙魚(AVP26899.1)、虹鱒(NP_001117956.1和NP_001117957.1)、大西洋鮭(XP_013992219.1)、日本鰻鱺(AXM42349.1和AXM42348.1)、黃鱔(AGM34484.1)、四川裂腹魚(ASU44863.1)、克氏原螯蝦(ALD48735.1)和居蟹皮海綿(CAE51212.1)的Foxl2氨基酸序列。

進化樹以NJ法采用MEGA 6.0[10-12]構建。人類Foxl1(NP_005241.1)作為外類群。數值表示1 000次試驗所得到的步展值，代表每一分支的可信度。除清水江鯉Foxl2a與Foxl2b為試驗克隆外，其余Foxl2蛋白序列來源于NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫。

1.2.5Foxl2在清水江鯉成體組織中的表達 成體(24個月)清水江鯉麻醉后按性別解剖取其腦、垂體、鰓、心臟、脾臟、肝臟、腸、卵巢、精巢及腎臟液氮速凍，組織勻漿后按RNAiso Plus操作說明提取總RNA，提取的總RNA(約5.0 μg)用DNase I處理，以減少或避免基因組DNA的污染。取總RNA(約2.0 μg)逆轉錄合成cDNA，用基因特異引物進行擴增，檢驗Foxl2a和Foxl2b在各個組織中的分布情況。同時以鯉魚β-Actin引物擴增為內參以驗證PCR過程中cDNA的質量。PCR擴增參數：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃30 s，72℃60 s，循環28圈；72℃最終延伸10 min，4℃保存。所有PCR產物最后在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，并用SYBR Green I染色后在凝膠成像系統中拍照記錄結果。

2 結果與分析

2.1 清水江鯉性腺的早期發育

通過組織學切片觀察發現，清水江鯉發育在孵化后50～90 d不能分辨性別(封2圖1a～c)，但能明顯分辨出生殖細胞，免疫組化(以Vasa為抗體)染色顯示生殖細胞為橢圓形，細胞核偏大(封2圖1a和c)；孵化后120 d的性腺出現初級精母細胞，初級精母細胞呈圓形小顆粒狀，胞質弱嗜酸性(封2圖1d)；孵化后150 d的性腺出現初級卵母細胞，初級卵母細胞呈圓形，核膜的內壁有核仁(封2圖1e)；孵化后240 d出現精細胞(封2圖1f)。

2.2 清水江鯉Foxl2序列比對及系統發生情況

基于RT-PCR、RACE和轉錄組數據發現，清水江鯉含有2個同源基因(Foxl2a和Foxl2b)， cDNA全長分別為1 057 bp和1 297 bp，完整ORF分別編碼307個和263個氨基酸。

通過對NCBI數據庫的搜索及比對，目前僅發現在硬骨魚類的斑馬魚、虹鱒、日本鰻鱺、金魚、斑點叉尾鮰、大西洋鮭及七彩神仙魚中存在Foxl2b，其中金魚存在2個Foxl2b(圖2)。

序列比對發現，清水江鯉Foxl2a與Foxl2b核苷酸序列相似性為50.16%，氨基酸序列相似性為44.01%。

通過氨基酸序列的比對，Foxl2a在硬骨魚類間有高度相似性，特別是中間區域Foxl家族含有的1個高度保守的約110個氨基酸的DNA-binding domain(DBD)(圖3)，氨基酸序列間的相似性為75.88%～99.02%。Foxl2b氨基酸序列僅在DBD區域相對保守(圖4)，其余區域相對不保守，氨基酸序列之間相似性為30.72%～90.08%。

2.3 Foxl2在清水江鯉成體組織中的表達

從圖5看出，清水江鯉Foxl2a僅在成體卵巢、腎臟及脾臟中表達，且在卵巢中的表達量高于脾臟和腎臟；Foxl2b僅在成體卵巢中表達。

注：B為腦，P為垂體，G為腮，H為心臟，S為脾臟，I為腸，L為肝臟，K為腎臟，T為精巢，O為卵巢，HK為頭腎。β-Actin為內參。

Note: B, brain; P, pituitary; G, gill; H, heart; S, spleen; I, intestines; L, liver; K, kidney; T, testis; O, ovary; HK, head kidney.β-Actin, internal reference.

圖5清水江鯉成體組織中Foxl2a和Foxl2b的表達模式

Fig.5 Expression pattern ofFoxl2aandFoxl2bin adult tissues of QingshuijiangC.carpio

3 結論與討論

清水江鯉性腺發育至孵化后90 d時，通過免疫組化(以生殖細胞特異性表達的Vasa為抗體)可以看到性腺中存在大量生殖細胞，但通過HE染色仍不能明顯分辨性別，而黃河鯉在80 d時性腺已出現組織學上明顯的分化[13]。清水江鯉性腺發育明顯晚于黃河鯉性腺發育，可能是由于清水江鯉主要分布于貴州省黔東南州、黔南州等地區，海拔相對較高、氣溫相對較低所致。此結論將為清水江鯉人工繁殖及選育提供理論基礎。

研究獲得清水江鯉2個Foxl2的同源基因Foxl2a和Foxl2b，并通過系統發生驗證。

目前僅在硬骨魚類的斑馬魚、日本鰻鱺、金魚、虹鱒及鯉中發現2個(或以上)Foxl2旁系同源基因，其中金魚存在2個Foxl2b旁系同源基因，而在人類、小鼠、雞、斑胸草雀、非洲爪蛙等四足類中未發現2個(或以上)Foxl2旁系同源基因，表明，魚類基因組中存在的2個Foxl2旁系同源基因可能是由發生在輻鰭魚出現早期的額外的基因組復制(魚類特有的基因組復制，3R)產生[14-15]。金魚中存在2個Foxl2b基因可能與金魚與鯽魚共同祖先發生的特有基因組復制(4R)相關[16]。其他魚類僅存在1個Foxl2旁系同源基因可能是由于大部分魚類基因組測序尚未完成，還未發現其他的Foxl2旁系同源，也有可能是進化過程中全基因組復制往往伴隨著快速的基因丟失[17]所致。

氨基酸序列分析表明，硬骨魚類Foxl2a氨基酸序列相對保守，特別在中間及C末端區，其在不同物種中的功能也較相似；而Foxl2b相對不保守，其在不同物種中的功能可能會有所不同。

對哺乳動物的研究表明，Foxl2(與硬骨魚類Foxl2a同源)幾乎參與了卵巢發育和功能的所有階段及顆粒細胞相關的病理學。Foxl2通過與細胞DNA結合來打開或關閉某些基因，幫助顆粒細胞發育和功能[18-19]。在斑馬魚中的研究表明，Foxl2a和foxl2b協同調節斑馬魚卵巢的分化和維持，Foxl2b在阻止卵巢分化為睪丸方面起主導作用[20]。與其他脊椎動物(包括硬骨魚類)不同，三斑海豬魚Foxl2在自然改變性別的魚類中可能有不同的作用[21]。BARON等[22]發現，虹鱒Foxl2a和Foxl2b在卵巢中有特異表達，但表達的時間模式不同。Foxl2a的表達與芳香化酶的水平相關，雌激素處理遺傳雄性個體則會使Foxl2a與Foxl2b的表達上調。通過RT-PCR發現，清水江鯉Foxl2a和Foxl2b均在卵巢有較高表達，而在精巢沒有表達，這與Foxl2a和Foxl2b在虹鱒中的情況相似，表明Foxl2a與Foxl2b能在清水江鯉雌性性腺發育過程中起重要作用。清水江鯉Foxl2a和Foxl2b的具體功能，還有待進一步研究。