水解羽毛粉最佳酶解條件的研究

陳 明，李 艷，朱愛(ài)萍，唐 芯，周 慧

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

隨著規(guī)模化養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，每年被廢棄的羽毛越來(lái)越多，不僅造成了一系列環(huán)境污染的問(wèn)題，而且也造成了蛋白源的大量浪費(fèi)。羽毛的合理加工應(yīng)用能很好的解決上述問(wèn)題。羽毛中85%～90%為角蛋白，含有大量的色氨酸、谷氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸等[1]。但其是一種硬蛋白，分子結(jié)構(gòu)中含有豐富的二硫鍵和氫鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很難被動(dòng)物消化吸收。所以，羽毛粉不能直接用于動(dòng)物飼料中，必須經(jīng)過(guò)一定的處理，破壞角質(zhì)蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，才能被動(dòng)物消化吸收利用。國(guó)內(nèi)外處理羽毛的加工工藝主要包括：高溫高壓水解法、酶解法、微生物發(fā)酵法、酸（堿）解法、膨化法。其中酶解法多于水解法結(jié)合[2]。角蛋白是一種中性緩沖不溶性多肽，一般的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶等）很難將其分解[3]。本試驗(yàn)選用水解羽毛粉為原料，采用角蛋白酶對(duì)其降解，對(duì)酶解條件（加酶量、水解時(shí)間、pH以及水解溫度）進(jìn)行研究，以期為水解羽毛粉工業(yè)化酶解提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)原料

水解羽毛粉（購(gòu)于連云港萬(wàn)事興飼料有限公司）、角質(zhì)蛋白酶、牛血清蛋白、85%磷酸、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250。

1.2 試驗(yàn)器材

電子分析天平（FA1104，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、連續(xù)式離心機(jī)（DL-5C，上海安亭科學(xué)儀器廠）、恒溫干燥箱（DHG-9101，江蘇金怡儀器科技有限公司）、溫控水浴鍋（HH-S，金壇市城東新瑞儀器廠）、pH酸度計(jì)（STARTER2100，上海毅暢實(shí)業(yè)有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試劑配制

蛋白質(zhì)染色劑和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液作為比色空白對(duì)照，兩種試劑配取方式參照張永彬方法[4]。

2.2 控制酶解條件單一變量因素

為確定角質(zhì)蛋白酶最大活力，將單一變量分別設(shè)為溫度、加酶量、水解時(shí)間及pH。利用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，在波長(zhǎng)595 nm的條件下測(cè)定酶解后產(chǎn)品的吸光度，從而對(duì)比吸光度值得出最佳的酶解條件，每個(gè)單因素試驗(yàn)進(jìn)行5個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)，取每個(gè)梯度的平均值從而減小試驗(yàn)誤差。

2.2.1 溫度對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

稱取水解羽毛粉0.5 g，倒入50 mL蒸餾水，pH 6.86，加酶量0.01 g，水解時(shí)間為5.5 h，水浴鍋溫度分別設(shè)為50、55、60、65、70和75℃，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液作為空白對(duì)照，測(cè)出水解羽毛粉的吸光度值。

2.2.2 加酶量對(duì)水解羽毛粉吸光度影響

稱取水解羽毛粉0.5 g，倒入50 mL蒸餾水，pH 6.86，水解溫度60℃，水解時(shí)間為5.5 h，加酶量分別設(shè)為0.01、0.012 5、0.01 5、0.017 5、0.02和0.022 5 g，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液作為空白對(duì)照，測(cè)出水解羽毛粉的吸光度。

2.2.3 水解時(shí)間對(duì)水解羽毛粉吸光度影響

稱取水解羽毛粉0.5 g，倒入50 mL蒸餾水，pH 6.86，加酶量0.01 g，水解溫度60℃，水解時(shí)間分別設(shè)為5、5.5、6、6.5、7和7.5 h，以配制的蛋白質(zhì)溶液作為空白對(duì)照，測(cè)出水解羽毛粉的吸光度。

2.2.4 pH對(duì)水解羽毛粉吸光度影響

稱取水解羽毛粉0.5 g，倒入50 mL蒸餾水，加酶量0.01 g，水解溫度60℃，水解時(shí)間為5.5 h，pH 分 別 設(shè)為 4.04、 5.42、 6.86、 7.59、 8.24 和9.18，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液作為空白對(duì)照，測(cè)出水解羽毛粉的吸光度。

2.3 水解羽毛粉的測(cè)定

水解結(jié)束后樣品放入離心機(jī)以3 000 r·min-1的速度離心10 min；離心結(jié)束后先取上清液0.6 mL加入具塞試管中，然后加入0.4 mL水，最后加入配好的考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL，搖勻靜置3 min，在波長(zhǎng)595 nm條件下測(cè)得產(chǎn)品的吸光度值。

2.4 羽毛蛋白降解率的計(jì)算及其驗(yàn)證

稱取水解羽毛粉Ag放入離心管中，再稱取水解羽毛粉和離心管的總質(zhì)量為Bg，按照最佳的酶解條件進(jìn)行水解，即：加酶量0.015 g、水解時(shí)間6 h、水解溫度65℃及pH 6.86進(jìn)行水解。水浴取出后放入離心機(jī)以3 000 r·min-1離心10 min，測(cè)定其吸光度；后除去上清液，將沉淀和離心管一起烘干后的稱總質(zhì)量為C，計(jì)算羽毛蛋白降解率，計(jì)算公式見(jiàn)式1。

空白對(duì)照：稱取水解羽毛粉Dg放入離心管中，再稱取水解羽毛粉和離心管的總質(zhì)量為Fg，水解時(shí)不加酶按照水解時(shí)間6 h、水解溫度65℃及pH 6.86進(jìn)行水解。水浴取出后放入離心機(jī)以3 000 r·min-1離心10 min，后除去上清液，將沉淀和離心管一起烘干后稱總質(zhì)量為G，計(jì)算方式同上，得出羽毛蛋白的降解率與加酶得出數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算公式見(jiàn)式2。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步處理，再用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和T檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度對(duì)水解羽毛粉吸光度影響

不同溫度對(duì)水解羽毛粉吸光度影響見(jiàn)表1。

由表1可知，水解溫度不同，水解羽毛粉的吸光度值不同。水解溫度為65℃時(shí)，吸光度值為0.54，數(shù)值最大。隨著溫度升高，吸光度呈下降趨勢(shì)。不同水解溫度，吸光度值65℃與其他溫度比較，差異極顯著（P＜0.01）。

3.2 不同加酶量對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

不同加酶量對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響見(jiàn)表2。由表2可知，不同加酶量下，水解羽毛粉的吸光度值不一樣。隨著加酶量的增加，吸光度值先增加后減小。加酶量為0.015 g時(shí)，吸光度值是0.59，數(shù)值最大。加酶量為0.015處的吸光度與其他組相比差異均極顯著（P＜0.01）。

表1 不同水解溫度對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

表2 不同加酶量對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

3.3 不同水解時(shí)間對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

不同水解時(shí)間對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響表3。

由表3可知，不同水解時(shí)間下水解羽毛粉的吸光度值也均不同。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值先逐漸增大，再呈下降趨勢(shì)。水解時(shí)間6 h時(shí)，吸光度值為0.48，且值最大；此處吸光度與其他各處的吸光度值，差異均極顯著（P＜0.01）。

表3 不同水解時(shí)間對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

3.4 不同pH對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

不同pH對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響見(jiàn)表4。

由表4可知，不同pH相對(duì)應(yīng)的水解羽毛粉的吸光度值也不同。在pH為6.86時(shí)，吸光度值約為0.59且值最大；pH為6.86處的吸光度值與其他pH處的吸光度值比較，差異均極顯著（P＜0.01）。

表4 不同pH對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

3.5 蛋白質(zhì)降解率比較驗(yàn)證

水解羽毛粉和水解羽毛粉蛋白降解率比較見(jiàn)表5。

由表5可知，水解羽毛粉蛋白質(zhì)降解率和加酶試驗(yàn)組（加酶量為0.015 g、水解時(shí)間為6 h、水解溫度為65℃、pH 6.86），分別做5次平行，求蛋白質(zhì)降解率，并進(jìn)行“T檢驗(yàn)”，兩者試驗(yàn)結(jié)果差異極顯著（P＜0.01）。

表5 水解羽毛粉和水解羽毛粉蛋白降解率比較

4討 論

4.1 不同溫度對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

酶的活性與溫度有關(guān)，每種酶都有其最適水解溫度。在某一水解溫度下，有最大的酶活性，溫度越低或越高時(shí)，都會(huì)使酶的活性降低甚至失活。本次試驗(yàn)溫度＜65℃時(shí)，吸光度值隨溫度的增大而增大，則酶的活力隨溫度的增長(zhǎng)而增大，從而可溶性蛋白含量也越來(lái)越大；溫度＞65℃時(shí)，吸光度值隨著溫度的升高而減小，則酶的活力也越來(lái)越小，從而蛋白質(zhì)降解率越來(lái)越小。由此可知，在所設(shè)溫度梯度中，水解溫度為65℃時(shí)水解羽毛粉中蛋白質(zhì)降解率最大，這與梁玥等試驗(yàn)結(jié)果是一致的[5]。

4.2 不同加酶量對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，加酶量＜0.015 g時(shí)，酶活力隨加酶量的增加逐漸增大，吸光度值隨著量的增加而增大，蛋白質(zhì)降解率也越來(lái)越大；加酶量＞0.015 g時(shí)，吸光度值隨著加酶量的增大而減小，從而蛋白質(zhì)降解率越來(lái)越小，可能是因?yàn)榧用噶砍鲆欢ǚ秶a(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

4.3 不同水解時(shí)間對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

試驗(yàn)中，水解時(shí)間＜6 h時(shí)，吸光度值越來(lái)越大，羽毛蛋白降解率隨著加時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，6 h之后，吸光度值逐漸減少，代表蛋白質(zhì)降解率越來(lái)越小，可能是蛋白質(zhì)進(jìn)一步被降解成氨基酸，使得可溶性蛋白質(zhì)含量變小的原因。

3.4 不同pH對(duì)水解羽毛粉吸光度的影響

pH對(duì)酶活力的影響比較大，過(guò)度的酸性或堿性都會(huì)破壞酶的活力。長(zhǎng)時(shí)間在堿溶液中加熱易導(dǎo)致氨基酸消旋，使其不能與蛋白酶的底物結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，降低消化率[6]。本試驗(yàn)中，pH＜6.86時(shí)，吸光度值隨pH增長(zhǎng)而升高，則酶的活力隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，羽毛蛋白降解率也隨之增多；而pH＞6.86時(shí)，吸光度值逐漸降低，則酶的活力隨pH增長(zhǎng)而減小，羽毛蛋白降解率也隨之減少。可能在pH升高時(shí)，破壞了酶的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶失活，從而引起降解率下降，吸光度值也隨之減小。

5結(jié) 論

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，加酶條件下的水解羽毛粉蛋白質(zhì)降解率比普通水解羽毛粉降解率顯著提高，差異極顯著（P＜0.01）。本次試驗(yàn)研究確定水解羽毛粉的最佳酶解條件為：水解溫度65℃、加酶量0.015 g、水解時(shí)間6 h和pH 6.86。